Cardiac hypertrophy and heart failure caused by high blood pressure were studied in single myocytes taken from hypertensive rats (Dahl SS/Jr) and SH-HF rats in heart failure. Confocal microscopy and patch-clamp methods were used to examine excitation-contraction (EC) coupling, and the relation between the plasma membrane calcium current ( I Ca ) and evoked calcium release from the sarcoplasmic reticulum (SR), which was visualized as “calcium sparks.” The ability of I Ca to trigger calcium release from the SR in both hypertrophied and failing hearts was reduced. Because I Ca density and SR calcium-release channels were normal, the defect appears to reside in a change in the relation between SR calcium-release channels and sarcolemmal calcium channels. β-Adrenergic stimulation largely overcame the defect in hypertrophic but not failing heart cells. Thus, the same defect in EC coupling that develops during hypertrophy may contribute to heart failure when compensatory mechanisms fail.

The release of stored Ca2+ from intracellular pools triggers a variety of important neuronal processes. Physiological and pharmacological evidence has indicated the presence of caffeine-sensitive intracellular pools that are distinct from the well-characterized inositol 1,4,5,-trisphosphate (IP3)-gated pools. Here we report that the brain ryanodine receptor functions as a caffeine- and ryanodine-sensitive Ca2+ release channel that is distinct from the brain IP3 receptor. The brain ryanodine receptor has been purified 6700-fold with no change in [3H]ryanodine binding affinity and shown to be a homotetramer composed of an approximately 500 kd protein subunit, which is identified by anti-peptide antibodies against the skeletal and cardiac muscle ryanodine receptors. Our results demonstrate that the brain ryanodine receptor functions as a caffeine-sensitive Ca2+ release channel and thus is the likely gating mechanism for intracellular caffeine-sensitive Ca2+ pools in neurons.

Abstract Plakophilin-2 (PKP2) is a component of the desmosome and known for its role in cell–cell adhesion. Mutations in human PKP2 associate with a life-threatening arrhythmogenic cardiomyopathy, often of right ventricular predominance. Here, we use a range of state-of-the-art methods and a cardiomyocyte-specific, tamoxifen-activated, PKP2 knockout mouse to demonstrate that in addition to its role in cell adhesion, PKP2 is necessary to maintain transcription of genes that control intracellular calcium cycling. Lack of PKP2 reduces expression of Ryr2 (coding for Ryanodine Receptor 2), Ank2 (coding for Ankyrin-B), Cacna1c (coding for Ca V 1.2) and Trdn (coding for triadin), and protein levels of calsequestrin-2 (Casq2). These factors combined lead to disruption of intracellular calcium homeostasis and isoproterenol-induced arrhythmias that are prevented by flecainide treatment. We propose a previously unrecognized arrhythmogenic mechanism related to PKP2 expression and suggest that mutations in PKP2 in humans may cause life-threatening arrhythmias even in the absence of structural disease.

In polymicrobial sepsis, the extracellular histones, mainly released from activated neutrophils, significantly contribute to cardiac dysfunction (septic cardiomyopathy), as demonstrated in our previous studies using Echo-Doppler measurements. This study aims to elucidate the roles of extracellular histones and their interactions with Toll-like receptors (TLRs) in cardiac dysfunction. Through ex vivo assessments of ECG, left ventricle (LV) function parameters, and in vivo Echo-Doppler studies in mice perfused with extracellular histones, we aim to provide comprehensive insights into the mechanisms underlying sepsis-induced cardiac dysfunction. Langendorff-perfused hearts from both wild-type and TLR2, TLR3, or TLR4 knockout (KO) mice were examined. Paced mouse hearts were perfused with histones to assess contractility and relaxation. Echo-Doppler studies evaluated cardiac dysfunction after intravenous histone injection. Histone perfusion caused defects in contractility and relaxation, with TLR2 and TLR3 KO mice being partially protected. Specifically, TLR2 KO mice exhibited the greatest reduction in Echo-Doppler abnormalities, while TLR4 KO exacerbated cardiac dysfunction. Among individual histones, H1 induced the most pronounced abnormalities in cardiac function, apoptosis of cardiomyocytes, and LDH release. Our data highlight significant interactions between histones and TLRs, providing insights into histones especially H1 as potential therapeutic targets for septic cardiomyopathy. Further studies are needed to explore specific histone-TLR interactions and their mechanisms.

ABSTRACT Levels of the transcription factor ATF6α, a key mediator of the unfolded protein response, that provides cellular protection during the progression endoplasmic reticulum (ER) stress, are markedly reduced in the pancreatic islet of patients with type 2 diabetes and in rodent models of the disease, including ob/ob and high fat-fed mice. Sorcin (gene name SRI ) is a calcium (Ca 2+ ) binding protein involved in maintaining ER Ca 2+ homeostasis. We have previously shown that overexpressing sorcin under the rat insulin promoter in transgenic mice was protective against high fat diet-induced pancreatic beta cell dysfunction, namely preserving intracellular Ca 2+ homeostasis and glucose-stimulated insulin secretion during lipotoxic stress. Additionally, sorcin overexpression was apparently activating ATF6 signalling in MIN6 cells despite lowering ER stress. Here, in order to investigate further the relationship between sorcin and ATF6, we describe changes in sorcin expression during ER and lipotoxic stress and changes in ATF6 signalling after sorcin overexpression or inactivation, both in excitable and non-excitable cells. Sorcin mRNA levels were significantly increased in response to the ER stress-inducing agents thapsigargin and tunicamycin, but not by palmitate. On the contrary, palmitate caused a significant decrease in sorcin expression as assessed by both qRT-PCR and Western blotting despite inducing ER stress. Moreover, palmitate prevented the increase in sorcin expression induced by thapsigargin. In addition, sorcin overexpression significantly increased ATF6 transcriptional activity, whereas sorcin inactivation decreased ATF6 signalling. Finally, sorcin overexpression increased levels of ATF6 immunoreactivity and FRET imaging experiments following ER stress induction by thapsigargin showed a direct sorcin-ATF6 interaction. Altogether, our data suggest that sorcin down-regulation during lipotoxicity may prevent full ATF6 activation and a normal UPR during the progression of obesity and insulin resistance, contributing to beta cell failure and type 2 diabetes.

The cardiac Ca2+ release channel (RyR2) governs the release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum, essential for cardiac muscle contraction. Naturally occurring mutations in RyR2 have been linked to several forms of cardiac arrhythmias (CPVT, ARVC) that require a vulnerable substrate characterized by structural or electrical abnormalities and an acute initiating event. Recently, a RyR2V2475F mutation has been identified post-mortem on a young boy whose death has been associated with arrhythmias, related to higher Ca2+ sensitivity of the mutated RyR2. Our study aims to determine the arrhythmogenic mechanisms of the RyR2V2475F mutation by analyzing its impact on the ventricular action potential duration and Ca2+ homeostasis in a Knock-In rabbit model. Action Potentials (APs) were recorded using patch-clamp. Ca2+ sparks, SR Ca2+ load and Ca2+ transients have been analyzed using confocal microscopy. Ion channels expression was evaluated using RT-qPCR. With EGTA in the internal solution, APs of endocardial cardiomyocytes were shortened in RyR2V2475F mutants, with reduced APD20 and APD50 values compared to WT animals. This causes an inversion of the transmural repolarization gradient. The decrease of AP duration in endocardial cardiomyocytes was abolished in presence of BAPTA (a stronger Ca2+ chelator) in the internal solution. RyR2V2475F mutation did not alter K+ channel transcript levels. Ca2+ handling analysis showed a reduced diastolic Ca2+ sparks frequency, SR Ca2+ load and Ca2+ transients amplitudes. These results suggest a role of altered Ca2+ handling in AP lengthening that could represent the vulnerable substrate that favors the apparition of arrhythmias.

Automaticity of Sino-atrial node (SAN) pacemaker cells is regulated by integrated functions within a system of two coupled clocks: the so-called "membrane clock", dependent mainly on the funny current (If), and the denominated "Ca2+ clock", dependent mainly on the RyR2. During exercise or under stress, the pacemaker accelerates its rate (positive chronotropic effect) due to β-adrenergic stimulation. As a result, cAMP levels increase in the SAN cells and PKA is activated, phosphorylating different targets. While cAMP shifts the If activation curve increasing its availability, it is less clear whether phosphorylation of RyR2 affects SAN modulation by β-adrenergic stimulation. S2808 and S2030 are considered the major RyR2 phosphorylation sites that are substrates of PKA but few studies have addressed the role of S2030 in the regulation of RyR2. The main objective is to investigate the involvement of RyR2 phosphorylation by PKA in SAN modulation by β-adrenergic stimulation. Mice with phospho-ablation at the PKA sites (S2030A and S2808A) and mimetic phosphorylation (S2030D) of the RyR2 were compared to WT. Pacemaker activity was evaluated in vivo and ex vivo by EGC telemetry and confocal microscopy respectively. ECG was recorded at basal conditions and after stress (isoproterenol, epinephrine + caffeine injection). SAN were dissected from mice, loaded with intracellular calcium dye and visualised by confocal microscopy in basal conditions and under isoproterenol (ISO). In vivo, lack of PKA phosphorylation on Serine2030 (S2030A) induced an impaired positive chronotropic response after ISO injection compared to WT and S2030D mice. Moreover, both, S2030A and the phosphomimetic S2030D, presented more arrhythmias following epinephrine plus caffeine injection compared to WT. Ex-vivo, the [Ca2+]i transients rate of pacemaker cells failed to accelerate in S2030A compared to WT and S2030D when perfused with 20 nM isoproterenol. These results show that RyR2 phosphorylation at S2030 is involved in pacemaker response to beta-adrenergic stimulation.

ABSTRACT Background Ryanodine receptor 2 (RyR2) is one of the first substrates undergoing phosphorylation upon catecholaminergic stimulation. Yet, the role of RyR2 phosphorylation in the adrenergic response remains debated. To date, three residues in RyR2 are known to undergo phosphorylation upon adrenergic stimulation. We generated a model of RyR2 phospho-ablation of all three canonical phospho-sites (RyR2-S2031A/S2808A/S2814A, triple phospho-mutant, TPM) to elucidate the role of phosphorylation at these residues in the adrenergic response. Methods Cardiac structure and function, cellular Ca 2+ dynamics and electrophysiology, and RyR2 channel activity both under basal conditions and under isoproterenol (Iso) stimulation were systematically evaluated. We used echocardiography and electrocardiography in anesthetized mice, single-cell Ca 2+ imaging and whole-cell patch clamp in isolated adult cardiomyocytes, and biochemical assays. Results Iso stimulation produced normal chronotropic and inotropic responses in TPM mice as well as an increase in the global Ca 2+ transients in isolated cardiomyocytes. Functional studies revealed fewer Ca 2+ sparks in permeabilized TPM myocytes, and reduced RyR2-mediated Ca 2+ leak in intact myocytes under Iso stimulation, suggesting that the canonical sites may regulate RyR2-mediated Ca 2+ leak. TPM mice also displayed increased propensity for arrhythmia. TPM myocytes were prone to develop early afterdepolarizations (EADs), which were abolished by chelating intracellular Ca 2+ with EGTA, indicating that EADs require SR Ca 2+ release. EADs were also blocked by a low concentration of tetrodotoxin, further suggesting reactivation of the sodium current ( I Na ) as the underlying cause. Conclusion Phosphorylation of the three canonical residues on RyR2 may not be essential for the global adrenergic responses. However, these sites play a vital role in maintaining electrical stability during catecholamine stimulation by fine-tuning RyR2-mediated Ca 2+ leak. These findings underscore the importance of RyR2 phosphorylation and a finite diastolic Ca 2+ leak in maintaining electrical stability during catecholamine stimulation.

Abstract To study the structural basis of pathological remodelling and altered calcium channel functional states in the heart, we sought to re-purpose high-affinity ligands of the cardiac calcium channel, the ryanodine receptor (RyR2), into super-resolution imaging probes. Imperacalcin (IpCa), a scorpion toxin peptide which induces channel sub-conduction states, and DPc10, a synthetic peptide corresponding to a sequence of the RyR2, which replicates arrhythmogenic CPVT functional changes, were used in fluorescent imaging experiments. Isolated adult rat ventricular cardiomyocytes were saponin-permeabilised and incubated with each peptide. IpCa-A546 became sequestered into the mitochondria. This was prevented by treatment of the permeabilised cells with the ionophore FCCP, revealing a striated staining pattern in confocal imaging which had weak colocalisation with RyR2 clusters. Poor specificity (as an RyR2 imaging probe) was confirmed at higher resolution with expansion microscopy (proExM) (~70 nm). DPc10-FITC labelled a striated pattern, which had moderate colocalisation with RyR2 cluster labelling in confocal and proExM. There was also widespread non-target labelling of the Z-discs, intercalated discs, and nuclei, which was unaffected by incubation times or 10 mM caffeine. The inactive peptide mut-DPc10-FITC (which causes no functional effects) displayed a similar labelling pattern. Significant labelling of structures unrelated to RyR2 by both peptide conjugates makes their use as highly specific imaging probes of RyR2 in living isolated cardiomyocytes highly challenging. We investigated the native DPc10 sequence within the RyR2 structure to understand the domain interactions and proposed mechanism of peptide binding. The native DPc10 sequence does not directly interact with another domain, and but is downstream of one such domain interface. The rabbit Arg2475 (equivalent to human Arg2474, mutated in CPVT) in the native sequence is the most accessible portion and most likely location for peptide disturbance, suggesting FITC placement does not impact peptide binding.

Abstract We have previously demonstrated that type II ryanodine receptors (RyR2) tetramers can be rapidly rearranged in response to a phosphorylation cocktail. The cocktail modified downstream targets indiscriminately making it impossible to determine whether phosphorylation of RyR2 was an essential element of the response. We therefore used the β-agonist isoproterenol and mice with one of the homozygous mutations, S2030A +/+ , S2808A +/+ , S2814A +/+ , or S2814D +/+ , to address this question and to elucidate the role of these clinically relevant mutations. We measured the length of the dyad using transmission electron microscopy (TEM) and directly visualized RyR2 distribution using dual-tilt electron tomography. We found that: 1) The S2814D mutation, by itself, significantly expanded the dyad and reorganized the tetramers suggesting a direct link between the phosphorylation state of the tetramer and the microarchitecture. 2) All of the wild-type, as well as the S2808A and S2814A mice, had significant expansions of their dyads in response to ISO, while S2030A did not. 3) In agreement with functional data from the same mutants, S2030 and S2808 were necessary for a complete β-adrenergic response, whereas S2814 was not. 4) All the mutated residues had unique effects on the organization of their tetramer arrays. 5) The correlation of structure with function suggests that tetramer-tetramer contacts play an important functional role. We conclude that both the size of the dyad and the arrangement of the tetramers are linked to the state of the channel tetramer and can be dynamically altered by a β-adrenergic receptor agonist. Summary Analysis of RyR2 mutants suggests a direct link between the phosphorylation state of the channel tetramer and the microarchitecture of the dyad. All phosphorylation site mutations produced significant and unique effects on the structure of the dyad and its response to isoproterenol.