Abstract RNA polymerases (RNAPs) synthesize RNA from NTPs, whereas DNA polymerases synthesize DNA from 2’dNTPs. DNA polymerases select against NTPs by using steric gates to exclude the 2’ OH, but RNAPs have to employ alternative selection strategies. In single-subunit RNAPs, a conserved Tyr residue discriminates against 2’dNTPs, whereas selectivity mechanisms of multi-subunit RNAPs remain hitherto unknown. Here we show that a conserved Arg residue uses a two-pronged strategy to select against 2’dNTPs in multi-subunit RNAPs. The conserved Arg interacts with the 2’OH group to promote NTP binding, but selectively inhibits incorporation of 2’dNTPs by interacting with their 3’OH group to favor the catalytically-inert 2’-endo conformation of the deoxyribose moiety. This deformative action is an elegant example of an active selection against a substrate that is a substructure of the correct substrate. Our findings provide important insights into the evolutionary origins of biopolymers and the design of selective inhibitors of viral RNAPs.

All cellular RNA polymerases (RNAP) occasionally backtrack along the template DNA as part of transcriptional proofreading and regulation. Here, we studied the mechanism of RNAP backtracking by one nucleotide using two complementary approaches that allowed us to precisely measure the occupancy and lifetime of the backtracked state. Our data show that the stability of the backtracked state is critically dependent on the closure of the RNAP active site by a mobile domain, the trigger loop (TL). The lifetime and occupancy of the backtracked state measurably decreased by substitutions of the TL residues that interact with the nucleoside triphosphate (NTP) substrate, whereas amino acid substitutions that stabilized the closed active site increased the lifetime and occupancy. These results suggest that the same conformer of the TL closes the active site during catalysis of nucleotide incorporation into the nascent RNA and backtracking by one nucleotide. In support of this hypothesis, we construct a model of the 1-nt backtracked complex with the closed active site and the backtracked nucleotide in the entry pore area known as the E-site. We further propose that 1-nt backtracking mimics the reversal of the NTP substrate loading into the RNAP active site during on-pathway elongation.

Cell-free environments are becoming viable alternatives for implementing biological networks in synthetic biology. The reconstituted cell-free expression system (PURE) allows characterization of genetic networks under defined conditions but its applicability to native bacterial promoters and endogenous genetic networks is limited due to the poor transcription rate of Escherichia coli RNA polymerase in this minimal system. We found that addition of transcription elongation factors GreA and GreB to the PURE system increased transcription rates of E. coli RNA polymerase from sigma factor 70 promoters up to 6-fold and enhanced the performance of a genetic network. Furthermore, we reconstituted activation of natural E. coli promoters controlling flagella biosynthesis by the transcriptional activator FlhDC and sigma factor 28. Addition of GreA/GreB to the PURE system allows efficient expression from natural and synthetic E. coli promoters and characterization of their regulation in minimal and defined reaction conditions making the PURE system more broadly applicable to study genetic networks and bottom-up synthetic biology.

Abstract The expression of most bacterial genes commences with the binding of RNA polymerase (RNAP)–σ 70 holoenzyme to the promoter DNA. This initial RNAP–promoter closed complex undergoes a series of conformational changes, including the formation of a transcription bubble on the promoter and the loading of template DNA strand into the RNAP active site; these changes lead to the catalytically active open complex (RP O ) state. Recent cryo-electron microscopy studies have provided detailed structural insight on the RP O and putative intermediates on its formation pathway. Here, we employ single-molecule fluorescence microscopy to interrogate the conformational dynamics and reaction kinetics during real-time RP O formation. We find that the RP O pathway is branched, generating RP O complexes with different stabilities. The RNAP cleft loops, and especially the β’ rudder, stabilise the transcription bubble. The RNAP interactions with the promoter upstream sequence (beyond −35) stimulate transcription bubble nucleation and tune the reaction path towards stable forms of the RP O . The mechanistic heterogeneity of the RP O pathway may be a prerequisite for its regulation since such heterogeneity allows the amplification of small promoter sequence or transcription-factor-dependent changes in the free energy profile of the RP O pathway to large differences in transcription efficiency.

RNA polymerase (RNAP) mediates the synthesis of an RNA copy of the template DNA, the first and often decisive step in gene expression. All cellular RNAPs possess an additional capacity to cleave nucleotides from the 3' end of the nascent RNA. This ability potentially enhances the efficiency and accuracy of transcription, enabling RNAP to maintain processivity and ensure the fidelity of the RNA transcript. This study investigates the contributions of various active site regions to the RNA cleavage activity using a large collection of Escherichia coli RNAP variants. Unlike previous studies conducted under non-physiological conditions, this research employed backtracked RNAP complexes that cleave nascent RNA on a timescale of minutes under physiological pH and low Mg2+ concentrations. Our findings provide key insights into the RNA cleavage activity of the RNAP active site. Complete closure of the active site by the Trigger Loop (TL) facilitates RNA cleavage in 1-nt backtracked states, but not in 2-nt backtracked states. However, the RNA-proximal N-terminus of the TL influences the cleavage rate in both states. β subunit Asp814 plays an important role in RNA cleavage, regardless of backtracking depth, likely by coordinating the Mg2+ ion responsible for generating the nucleophile. During RNA cleavage, the pre-translocated RNA nucleotide is base-paired to the template DNA, but its sugar-phosphate backbone is shifted compared to canonical pre-translocated and NTP-bound states. Bulky substitutions in the E-site (NTP entry area) stimulate RNA cleavage, suggesting that RNA binding in this site inhibits the reaction.

SUMMARY RfaH, a paralog of the universally conserved NusG, binds to RNA polymerases (RNAP) and ribosomes to activate expression of virulence genes. In free, autoinhibited RfaH, an α-helical KOW domain sequesters the RNAP-binding site. Upon recruitment to RNAP paused at an ops site, KOW is released and refolds into a β-barrel, which binds the ribosome. Our structures of ops -paused transcription elongation complexes alone and bound to the autoinhibited and activated RfaH reveal swiveled, pre-translocated pause states stabilized by an ops hairpin in the non-template DNA. Autoinhibited RfaH binds and twists the ops hairpin, expanding the RNA:DNA hybrid to 11 base pairs and triggering the KOW release. Once activated, RfaH hyper-stabilizes the pause, which thus requires anti-backtracking factors for escape. Our results suggest that the entire RfaH cycle is solely determined by the ops and RfaH sequences and provide insights into mechanisms of recruitment and metamorphosis of NusG homologs across all life. HIGHLIGHTS - The nontemplate DNA strand of an ops -paused transcription complex forms a hairpin - Autoinhibited RfaH binds and twists the ops hairpin to expand the RNA:DNA hybrid - RfaH-hairpin contacts are solely responsible for triggering RfaH activation - Upon recruitment, RfaH hyper-stabilizes the pause and promotes RNAP backtracking