The forward genetic screen is a powerful, unbiased method to gain insights into biological processes, yet this approach has infrequently been used in vivo in mammals because of high resource demands. Here, we use in vivo somatic Cas9 mutagenesis to perform an in vivo forward genetic screen in mice to identify regulators of cardiomyocyte (CM) maturation, the coordinated changes in phenotype and gene expression that occur in neonatal CMs. We discover and validate a number of transcriptional regulators of this process. Among these are RNF20 and RNF40, which form a complex that monoubiquitinates H2B on lysine 120. Mechanistic studies indicate that this epigenetic mark controls dynamic changes in gene expression required for CM maturation. These insights into CM maturation will inform efforts in cardiac regenerative medicine. More broadly, our approach will enable unbiased forward genetics across mammalian organ systems.

HomeCirculationVol. 145, No. 10Efficient In Vivo Homology-Directed Repair Within Cardiomyocytes Free AccessLetterPDF/EPUBAboutView PDFView EPUBSections ToolsAdd to favoritesDownload citationsTrack citationsPermissions ShareShare onFacebookTwitterLinked InMendeleyRedditDiggEmail Jump toFree AccessLetterPDF/EPUBEfficient In Vivo Homology-Directed Repair Within Cardiomyocytes Yanjiang Zheng, PhD, Nathan J. VanDusen, PhD, Catalina E. Butler, BS, Qing Ma, MD, Justin S. King, BS and William T. Pu, MD Yanjiang ZhengYanjiang Zheng Department of Biochemistry, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu, China (Y.Z.). , Nathan J. VanDusenNathan J. VanDusen Correspondence to: Nathan J. VanDusen, PhD, or William T. Pu, MD, 300 Longwood Ave, Boston, MA 02115. Email E-mail Address: [email protected] or E-mail Address: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2636-7228 Department of Cardiology, Boston Children’s Hospital, MA (Y.Z., N.J.V., C.E.B., Q.M., J.S.K., W.T.P.). , Catalina E. ButlerCatalina E. Butler https://orcid.org/0000-0002-0096-0197 Department of Cardiology, Boston Children’s Hospital, MA (Y.Z., N.J.V., C.E.B., Q.M., J.S.K., W.T.P.). , Qing MaQing Ma Department of Cardiology, Boston Children’s Hospital, MA (Y.Z., N.J.V., C.E.B., Q.M., J.S.K., W.T.P.). , Justin S. KingJustin S. King Department of Cardiology, Boston Children’s Hospital, MA (Y.Z., N.J.V., C.E.B., Q.M., J.S.K., W.T.P.). and William T. PuWilliam T. Pu https://orcid.org/0000-0002-4551-8079 Department of Cardiology, Boston Children’s Hospital, MA (Y.Z., N.J.V., C.E.B., Q.M., J.S.K., W.T.P.). Harvard Stem Cell Institute, Cambridge, MA (W.T.P.). Originally published7 Mar 2022https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.120.052383Circulation. 2022;145:787–789CRISPR/Cas9-based genome editing technologies provide powerful tools for genetic manipulation. Cas9 in vivo genome editing of cardiomyocytes through nonhomologous end joining efficiently creates insertion–deletion mutations at guide RNA–targeted sites.1 However, precise addition of new genetic information, or mutation correction, requires alternate strategies. Delivery of Cas9 and a homology directed repair (HDR) template using adeno-associated virus (AAV) was recently shown to enable creation of precise genomic edits, even within postmitotic cells.2 We studied CRISPR/Cas9 and AAV-based homology directed repair (CASAAV-HDR) in cardiomyocytes. Animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee and adhered to institutional guidelines. The authors will provide data, results, and reagents on reasonable request.We studied CASAAV-HDR at Myl2 (MLC2v), a highly expressed, ventricle-specific sarcomere gene. We constructed AAV9 with an Myl2-specific guide RNA and a promoterless HDR template that replaces the native stop codon with self-cleaving 2A peptide followed by mScarlet, a red fluorescent protein (Figure [A]). Subcutaneous delivery of the AAV to postnatal day 0 mice with cardiac-restricted Cas9 expression (Tnnt2Cre;Rosa26fsCas9-P2A-GFP) yielded strong mScarlet expression in postnatal day 7 ventricular cardiomyocytes (Figure [Bi and C]). mScarlet expression required Cas9 and Myl2 homology arms (Figure [Bii and Biii]). AAV-delivered Cas9 successfully directed mScarlet expression, albeit with reduced efficiency compared with Rosa26fsCas9-P2A-GFP (Figure [Biv]). Guide RNAs targeting sequences on either side of the stop codon had equivalent performance (data not shown). We did not detect mScarlet in atrial cardiomyocytes, consistent with the targeted Myl2 allele retaining its expression pattern (Figure [C], top). Parallel experiments targeting atrial-specific Myl7 (MLC2a) resulted in mScarlet expression within atrial but not ventricular cardiomyocytes (Figure [C], bottom). Flow cytometry quantification of Myl2 knockin efficiency after systemic AAV injection showed that ≈45% of ventricular cardiomyocytes displayed strong fluorescence, with steep dose response (Figure [D]). In atrial cardiomyocytes, Myl7 knockin efficiency at the cellular level was 20% and had similar dose response (Figure [D]).Download figureDownload PowerPointFigure. CASAAV-HDR targeted transgene insertion is highly efficient in neonatal and terminally differentiated cardiomyocytes in vivo.Unless noted otherwise, adeno-associated virus (AAV) was delivered subcutaneously at postnatal day 0 (P0) and hearts were analyzed at postnatal day 7 (P7). A, CRISPR/Cas9/AAV9-based somatic mutagenesis (CASAAV)–homology directed repair (HDR) strategy to insert P2A-mScarlet at the stop codon of endogenous Myl2. Cas9 was expressed specifically in cardiomyocytes in Tnnt2Cre;Rosa26fsCas9-P2A-GFP mice. Cas9-induced double strand breaks can be repaired by HDR or nonhomologous end joining (NHEJ). Blue lines, homology arms; open arrows, primers used for amplicon sequencing. Unless noted otherwise, AAV9 was delivered subcutaneously at P0 and hearts were analyzed at P7. B, CASAAV-HDR integration of P2A-mScarlet at Myl2. i, AAV9-HDR-Myl2, CASAAV-HDR vector targeting Myl2, was delivered to Tnnt2Cre;Rosa26fsCas9-P2A-GFP mice. ii, No Cas9 vector was delivered without Cas9 expression. iii, AAV similar to AAV9-HDR-Myl2 but lacking homology arms was delivered to Tnnt2Cre;Rosa26fsCas9-P2A-GFP mice. iv, AAV-Cas9, AAV9-HDR-Myl2, plus AAV9-Tnnt2-Cas9 was delivered to wild-type mice. Scale bar, 50 µm. C, CASAAV-HDR vectors targeting Myl2 or Myl7 resulted in mScarlet expression specifically in ventricular or atrial chambers. Scale bar, 50 µm. D, CASAAV-HDR dose response. AAV was administered at high, middle, and low doses (5×1011, 5×1010, and 5×109 vg/g, respectively), resulting in ≈96%, 83%, and 51% myocardial transduction, respectively. Cardiomyocytes, dissociated by Langendorff perfusion, were analyzed for GFP expression by flow cytometry. E, Quantification of mutations induced by high-dose CASAAV-HDR insertion of P2A-mScarlet into the C terminus of Myl2 or Myl7. The junctions between inserted sequence and endogenous sequence were amplified from cDNA. Primers are illustrated in A. For alleles lacking an insert, a fragment was amplified from DNA using primers flanking the guide RNA target site. Amplicons were deeply sequenced and analyzed for the indicated types of modifications. F, Myl2 HDR efficiency in fetal, neonatal, or mature cardiomyocytes. AAV was administered at equivalent middle dose (5×1010 vg/g; E15.5 embryo = 0.6 g) at each stage, resulting in 80% to 83% myocardial transduction. mScarlet-expressing cardiomyocytes were quantified by flow cytometry. Differences between groups were not significant. G, Summary of HDR efficiency at 9 different loci, as a function of gene expression level in P0 ventricular cardiomyocytes, or atrial cardiomyocytes in the case of Myl7. Homology arms were ≈1 kb long. Shading indicates 95% CI for fitted line. H, Adult heart with insertion of mScarlet into the Pln locus after P0 administration of CASAAV-HDR vector. Scale bar, 200 µm. I, In situ imaging showing localization of mScarlet fused to Pln or Ttn in mature cardiomyocytes. Scale bar, 10 µm. **Dunnett P<0.001. *P<0.01. Error bars reflect standard error.We quantified mutations created during the CASAAV-HDR DNA repair process (Figure [E]). The 5′ and 3′ junctions between the inserted template and the endogenous Myl2 or Myl7 sequences were amplified from RNA and deeply sequenced. We also quantified mutations in alleles that did not contain an inserted template by amplifying and sequencing cardiomyocyte genomic DNA flanking the guide RNA target site. For Myl2, 95.9% and 99.4% of transcripts containing the inserted template had the expected 5′ or 3′ junction sequences, respectively, whereas 11.3% of alleles lacking an insert contained a mutation, reflecting nonhomologous end joining (Figure [E]). For Myl7, these numbers were 85.8%, 97.8%, and 27.1%, respectively (Figure [E]). These data indicate that CASAAV-HDR insertion is precise and that a subset of alleles without repair template integration contained nonhomologous end joining–induced mutations. Integration of AAV-inverted terminal repeats at Myl2 or Myl7 was detected in <2% of sequences (Figure [E]). Inverted terminal repeat sequencing found inverted terminal repeat integration elsewhere in the genome 4- to 28-fold less frequently than at Myl2.Although HDR has been thought to be limited to proliferating cells,3 CASAAV-HDR occurred in postmitotic neurons and in postmitotic adult cardiomyocytes.2,4 We assessed the effect of cardiomyocyte proliferation on CASAAV-HDR efficiency by measuring CASAAV-HDR at Myl2 at different developmental stages. CASAAV-HDR efficiency at the cellular level was comparable when AAV was delivered to fetal, neonatal, or mature mice (Figure [F]). Because of technical limitations, we were unable to quantify the fraction of cardiomyocyte genomes successfully modified by HDR and make comparisons among AAV delivery times at the genome level.We targeted 7 additional loci—Yap1, Tmem43, Nfatc3, Bdh1, Mkl1, Ttn, and Pln—fusing either an HA tag or mScarlet to each. Insertion efficiency varied dramatically between loci, with HDR efficiency at the cellular level generally correlating with target gene expression (Figure [G]). The 5 lowly expressed genes (<5 transcripts per million) had low HDR efficiency, whereas ≥20% of cardiomyocytes were edited in each of the 4 robustly expressed genes (>100 transcripts per million; Figure [G and H]). TTN-mScarlet and mScarlet-PLN fusion proteins localized to the sarcomere and sarcoplasmic reticulum, respectively, consistent with the localization of the endogenous proteins (Figure [I]).Systemic delivery of CASAAV-HDR vectors achieved efficient and precise in vivo somatic genome modification that did not require cardiomyocyte proliferation. Efficiency correlated with expression level of the target gene and in the best case reached remarkably high levels (45% of cardiomyocytes). While this article was in preparation, limited success with CASAAV-HDR in the heart was reported, although HDR efficiency was low and required direct intramyocardial injection because systemic delivery was unsuccessful.5 We successfully used CASAAV-HDR to monitor protein localization and anticipate it will be useful for many other applications, such as precise introduction of mutations to model disease or probe gene function. CASAAV-HDR may also enable efficient, permanent, and precisely targeted delivery of therapeutic transgenes to validated loci. We envision future studies will further expand research and translational applications by identifying attributes of loci that make them amenable to efficient HDR.Article InformationSources of FundingDr Zheng was funded by the Chinese Scholarship Council. Drs VanDusen (grant K99HL143194) and Pu (grants 2UM1 HL098166 and R01 HL146634) were supported by the National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute.Nonstandard Abbreviations and AcronymsAAVadeno-associated virusCASAAVCRISPR/Cas9/AAV9-based somatic mutagenesisHDRhomology directed repairDisclosures None.Footnotes*Y. Zheng and N.J. VanDusen contributed equally.For Sources of Funding and Disclosures, see page 789.Circulation is available at www.ahajournals.org/journal/circCorrespondence to: Nathan J. VanDusen, PhD, or William T. Pu, MD, 300 Longwood Ave, Boston, MA 02115. Email nathan.[email protected]harvard.edu or william.[email protected]chboston.orgReferences1. Guo Y, VanDusen NJ, Zhang L, Gu W, Sethi I, Guatimosim S, Ma Q, Jardin BD, Ai Y, Zhang D, et al.. Analysis of cardiac myocyte maturation using CASAAV, a platform for rapid dissection of cardiac myocyte gene function in vivo.Circ Res. 2017; 120:1874–1888. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.310283LinkGoogle Scholar2. Nishiyama J, Mikuni T, Yasuda R. Virus-mediated genome editing via homology-directed repair in mitotic and postmitotic cells in mammalian brain.Neuron. 2017; 96:755–768.e5. doi: 10.1016/j.neuron.2017.10.004CrossrefMedlineGoogle Scholar3. Yeh CD, Richardson CD, Corn JE. Advances in genome editing through control of DNA repair pathways.Nat Cell Biol. 2019; 21:1468–1478. doi: 10.1038/s41556-019-0425-zCrossrefMedlineGoogle Scholar4. Ishizu T, Higo S, Masumura Y, Kohama Y, Shiba M, Higo T, Shibamoto M, Nakagawa A, Morimoto S, Takashima S, et al.. Targeted genome replacement via homology-directed repair in non-dividing cardiomyocytes.Sci Rep. 2017; 7:9363. doi: 10.1038/s41598-017-09716-xCrossrefMedlineGoogle Scholar5. Kohama Y, Higo S, Masumura Y, Shiba M, Kondo T, Ishizu T, Higo T, Nakamura S, Kameda S, Tabata T, et al.. Adeno-associated virus-mediated gene delivery promotes S-phase entry-independent precise targeted integration in cardiomyocytes.Sci Rep. 2020; 10:15348. doi: 10.1038/s41598-020-72216-yCrossrefMedlineGoogle Scholar Previous Back to top Next FiguresReferencesRelatedDetailsCited ByLiu N and Olson E (2022) CRISPR Modeling and Correction of Cardiovascular Disease, Circulation Research, 130:12, (1827-1850), Online publication date: 10-Jun-2022. March 8, 2022Vol 145, Issue 10Article InformationMetrics © 2022 American Heart Association, Inc.https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.120.052383PMID: 35254919 Originally publishedMarch 7, 2022 Keywordsmyocytes, cardiacgenome editingCRISPR-associated protein 9homology-directed dsDNA break repairPDF download Advertisement SubjectsAnimal Models of Human DiseaseGene TherapyGenetically Altered and Transgenic Models

ABSTRACT Between birth and adulthood cardiomyocytes (CMs) undergo dramatic changes in size, ultrastructure, metabolism, and gene expression, in a process collectively referred to as CM maturation. The transcriptional network that coordinates CM maturation is poorly understood, creating a bottleneck for cardiac regenerative medicine. Forward genetic screens are a powerful, unbiased method to gain novel insights into transcriptional networks, yet this approach has rarely been used in vivo in mammals because of high resource demands. Here we utilized somatic mutagenesis to perform the first reported in vivo CRISPR genetic screen within a mammalian heart. We discovered and validated several novel transcriptional regulators of CM maturation. Among them were RNF20 and RNF40, which form a complex that monoubiquitinates H2B on lysine 120. Mechanistic studies indicated that this epigenetic mark controls dynamic changes in gene expression required for CM maturation. These insights into CM maturation will inform efforts in cardiac regenerative medicine. More broadly, our approach will enable unbiased forward genetics across mammalian organ systems.

The rapid improvement of descriptive genomic technologies has fueled a dramatic increase in hypothesized connections between cardiovascular gene expression and phenotypes. However, in vivo testing of these hypotheses has predominantly been relegated to slow, expensive, and linear generation of genetically modified mice. In the study of genomic cis-regulatory elements, generation of mice featuring transgenic reporters or cis-regulatory element knockout remains the standard approach. While the data obtained is of high quality, the approach is insufficient to keep pace with candidate identification and therefore results in biases introduced during the selection of candidates for validation. However, recent advances across a range of disciplines are converging to enable functional genomic assays that can be conducted in a high-throughput manner. Here, we review one such method, massively parallel reporter assays (MPRAs), in which the activities of thousands of candidate genomic regulatory elements are simultaneously assessed via the next-generation sequencing of a barcoded reporter transcript. We discuss best practices for MPRA design and use, with a focus on practical considerations, and review how this emerging technology has been successfully deployed in vivo. Finally, we discuss how MPRAs are likely to evolve and be used in future cardiovascular research.

Abstract Background The cardiac troponin T (Tnnt2) promoter is broadly utilized for cardiac specific gene expression, particularly via adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer. However, these vectors drive lower-level ectopic gene expression in other tissues, most notably in the liver. Whether the AAV- Tnnt2 vectors remain tissue-specific in applications sensitive to low or transient gene expression, such as gene editing, remains unclear. Methods The tissue specificity of AAV9- Tnnt2 vectors was evaluated in mice using Cre-LoxP-based fluorescence reporters and CRISPR/Cas9-mediated somatic mutagenesis. CRISPR/Cas9-triggered AAV integration into host genome was further assessed by quantitative PCR. Results In mice treated with AAV- Tnnt2 -GFP, GFP signal was specifically observed in the heart by confocal imaging. However, when AAV- Tnnt2 -Cre was administered to mice carrying LoxP-STOP-LoxP fluorescence reporters, the reporter signals were observed in up to 50% hepatic cells. Similarly, the AAV- Tnnt2 -SaCas9 vector extensively edited the hepatic genome as measured by targeted amplicon-sequencing. Cas9-triggered AAV integration into the host genome was also validated in the liver. Inclusion of target sequences for microRNA-122, a highly expressed, liver-specific microRNA, in the AAV transgene’s 3’ untranslated region (3’ UTR) markedly reduced ectopic transgene expression, genome editing and AAV integration in the liver. Conclusions The heavily used AAV- Tnnt2 system exhibits liver leakiness that severely impairs the cardiac specificity of AAV-based genetic manipulation. This problem can be mitigated via miR122-mediated liver detargeting.

Abstract Precise genome-editing platforms are versatile tools for generating specific, site-directed DNA insertions, deletions, and substitutions. The continuous enhancement of these tools has led to a revolution in the life sciences, which promises to deliver novel therapies for genetic disease. Precise genome-editing can be traced back to the 1950s with the discovery of DNA’s double-helix and, after 70 years of development, has evolved from crude in vitro applications to a wide range of sophisticated capabilities, including in vivo applications. Nonetheless, precise genome-editing faces constraints such as modest efficiency, delivery challenges, and off-target effects. In this review, we explore precise genome-editing, with a focus on introduction of the landmark events in its history, various platforms, delivery systems, and applications. First, we discuss the landmark events in the history of precise genome-editing. Second, we describe the current state of precise genome-editing strategies and explain how these techniques offer unprecedented precision and versatility for modifying the human genome. Third, we introduce the current delivery systems used to deploy precise genome-editing components through DNA, RNA, and RNPs. Finally, we summarize the current applications of precise genome-editing in labeling endogenous genes, screening genetic variants, molecular recording, generating disease models, and gene therapy, including ex vivo therapy and in vivo therapy, and discuss potential future advances.

Between birth and adulthood, cardiomyocytes (CMs) undergo profound changes in size, ultrastructure, metabolism, and gene expression, a process collectively referred to as CM maturation. Although highly coordinated, the transcriptional network that governs this process is not understood. This lack of understanding is a barrier to cardiac regenerative medicine, where our current inability to mature CMs differentiated from non-myocytes limits their use for disease modeling or replacement therapy. In addition, disruption of maturation by abnormal hemodynamic loads in neonates who have undergone surgery to correct congenital heart defects likely contributes to their high incidence of heart failure in adulthood. A sound understanding of the regulatory network governing CM maturation will inspire hypothesis driven attempts to surmount these challenges. In mice, a key hallmark of CM maturation is sarcomere isoform switching, including the well documented neonatal switch from Myosin Heavy Chain 7 (Myh7) to Myosin Heavy Chain 6 (Myh6). We have conducted and validated an in vivo high throughput CRISPR screen for transcriptional regulators of CM maturation, using the Myh7/6 isoform switch as the readout. Two top candidates from this screen, Rnf20 and Rnf40, form a complex which deposits the epigenetic mark H2bub1 (histone-2B mono-ubiquitinated on lysine 120). Defects in RNF20/40 and H2Bub1 regulation have been associated with human congenital heart disease, but their mechanistic function in the heart has not been studied. We performed ChIP and RNA-sequencing experiments in control and RNF loss-of-function models to characterize the role of H2Bub1 in transcriptional control of CM maturation. The resulting mechanistic insights into how gene expression is coordinately controlled during maturation will inform efforts to improve CM production protocols and develop targeted therapies.

CRISPR/Cas9-based genome editing technologies provide powerful tools for genetic manipulation. Delivery of Cas9 and a homology directed repair (HDR) template using adeno-associated virus (AAV; CASAAV-HDR), was recently shown to enable creation of precise genomic edits, even within postmitotic cells. Here we studied CASAAV-HDR in cardiomyocytes. We constructed an AAV9 vector containing a gRNA targeting the ventricle specific Myl2 gene, and a promoterless HDR template that replaces the native Myl2 stop codon with a self-cleaving 2A peptide followed by mScarlet, a red fluorescent protein. When this vector was injected into Cas9 expressing newborn mice, we observed mScarlet expression within a remarkably high fraction of cardiomyocytes, approximately 45%. Expression was ventricle specific, consistent with the Myl2 expression profile. Similarly, when we targeted the atrial specific Myl7 gene, we observed mScarlet expression in ~20% of atrial cardiomyocytes. Amplicon sequencing of Myl2 and Myl7 transcripts showed that the vast majority of transcripts with an insertion were mutation-free, indicating that CASAAV-HDR is precise. Furthermore, CASAAV-HDR efficiency was comparable when AAV was delivered to fetal, neonatal, or mature mice. Next we targeted seven additional loci: Yap1, Tmem43, Nfatc3, Bdh1, Mkl1, Ttn, and Pln, fusing either an HA tag or mScarlet to each. Insertion efficiency varied dramatically between loci, with HDR efficiency generally correlating with target gene expression. TTN-mScarlet and mScarlet-PLN fusion proteins localized to the sarcomere and sarcoplasmic reticulum, respectively, consistent with the localization of the endogenous proteins. Collectively these data indicate that systemic delivery of CASAAV-HDR vectors can achieve efficient, precise, in vivo somatic genome modification that does not require cardiomyocyte proliferation. We successfully used this technology to monitor protein localization and anticipate it will be useful for many other applications, such as precise introduction of mutations to model disease or probe gene function. CASAAV-HDR may also enable efficient, permanent, and precisely targeted delivery of therapeutic transgenes to validated loci.

Meiosis is a specialized cell division process that generates gametes for sexual reproduction. However, the factors and underlying mechanisms involving meiotic progression remain largely unknown, especially in humans. Here, it is first showed that HSF5 is associated with human spermatogenesis. Patients with a pathogenic variant of HSF5 are completely infertile. Testicular histologic findings in the patients reveal rare postmeiotic germ cells resulting from meiotic prophase I arrest. Hsf5 knockout (KO) mice confirms that the loss of HSF5 causes defects in meiotic recombination, crossover formation, sex chromosome synapsis, and sex chromosome inactivation (MSCI), which may contribute to spermatocyte arrest at the late pachytene stage. Importantly, spermatogenic arrest can be rescued by compensatory HSF5 adeno-associated virus injection into KO mouse testes. Mechanistically, integrated analysis of RNA sequencing and chromatin immunoprecipitation sequencing data revealed that HSF5 predominantly binds to promoters of key genes involved in crossover formation (e.g., HFM1, MSH5 and MLH3), synapsis (e.g., SYCP1, SYCP2 and SYCE3), recombination (TEX15), and MSCI (MDC1) and further regulates their transcription during meiotic progression. Taken together, the study demonstrates that HSF5 modulates the transcriptome to ensure meiotic progression in humans and mice. These findings will aid in genetic diagnosis of and potential treatments for male infertility.