Technology utilizing human induced pluripotent stem cells (iPS cells) has enormous potential to provide improved cellular models of human disease. However, variable genetic and phenotypic characterization of many existing iPS cell lines limits their potential use for research and therapy. Here we describe the systematic generation, genotyping and phenotyping of 711 iPS cell lines derived from 301 healthy individuals by the Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative. Our study outlines the major sources of genetic and phenotypic variation in iPS cells and establishes their suitability as models of complex human traits and cancer. Through genome-wide profiling we find that 5–46% of the variation in different iPS cell phenotypes, including differentiation capacity and cellular morphology, arises from differences between individuals. Additionally, we assess the phenotypic consequences of genomic copy-number alterations that are repeatedly observed in iPS cells. In addition, we present a comprehensive map of common regulatory variants affecting the transcriptome of human pluripotent cells. Genetic and phenotypic analysis reveals expression quantitative trait loci in human induced pluripotent stem cell lines associated with cancer and disease. The Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative (HipSci) has resulted in the generation, genotyping and phenotyping of more than 700 human induced pluripotent stem (iPS) cell lines derived from 300 healthy individuals. Although analysis of these data indicates that most of the variations in phenotypes between cells arise from variations between individuals, the authors also assess the consequences of the rare genetic defects that are recurrently seen in iPS cells after reprogramming and provide a map of the common regulatory variants that can change the transcriptome of human pluripotent cells. This resource will be useful for genetic studies of complex traits and cancer.

Abstract Recent developments in stem cell biology have enabled the study of cell fate decisions in early human development that are impossible to study in vivo. However, understanding how development varies across individuals and, in particular, the influence of common genetic variants during this process has not been characterised. Here, we exploit human iPS cell lines from 125 donors, a pooled experimental design, and single-cell RNA-sequencing to study population variation of endoderm differentiation. We identify molecular markers that are predictive of differentiation efficiency of individual lines, and utilise heterogeneity in the genetic background across individuals to map hundreds of expression quantitative trait loci that influence expression dynamically during differentiation and across cellular contexts.

Abstract To improve understanding of the role of site-specific proline hydroxylation in controlling protein function, we have developed a robust workflow for the identification of proline hydroxylation sites in proteins using a combination of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) enrichment and high-resolution nano-Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Using this approach, together with refining and filtering parameters during data analysis, by combining the results from cell lines being treated with either the prolyl hydroxylase inhibitor Roxadustat (FG-4592, FG) or the proteasome inhibitor MG-132 (MG), or DMSO, a total of 4,993 and 3,247 proline hydroxylation sites were identified in HEK293 and RCC4 samples, respectively. A subset of 1,954 and 1,253 high confident proline hydroxylation sites (non-collagen) from HEK293 and RCC4 samples were inhibited by FG-4592 treatment. A set of features characteristic of proline hydroxylated peptides were identified in both datasets, which differ from either unmodified peptides, or oxidised peptides. Peptides containing hydroxyproline were enriched in the more hydrophilic HILIC fractions and showed characteristic differences in charge and mass distribution, as compared with unmodified or oxidised peptides. Furthermore, we discovered that the intensity of the diagnostic hydroxyproline immonium ion was greatly influenced by parameters including the MS collision energy setting, parent peptide concentration and the sequence of adjacent amino acids neighbouring the modified proline. We show using synthetic peptides that a combination of retention time in LC and optimised MS parameter settings allows reliable identification of proline hydroxylation sites in peptides, even when multiple prolines residues are present. By matching all the proline hydroxylated, non-collagen proteins to the Pfam database, the most common protein family domains identified in both HEK293 and RCC4 datasets were RNA recognition motif (RRM_1), WD40 repeat (WD40), and protein kinase domain (Pkinase). Sequence analysis of the hydroxylated peptides showed enrichment for the motif GxPGxx, including the Gxx repeats found in collagen proteins, as well as the protein kinase domain GTP motif. Glycine (G), serine (S) and glutamic acid (E) residues were found frequently in the sequence window from the hydroxylated peptides. Reactome pathway analysis for the proteins of these newly identified proline hydroxylation sites (FG inhibited), showed enrichment for proteins involved in metabolism of RNA, mRNA splicing and cell cycle regulation, potentially mediated by prolyl hydroxylase enzymes (PHDs).

Transposable elements (TEs) are mobile genetic modules of viral derivation that have been co-opted to become modulators of mammalian gene expression. TEs are a major source of endogenous dsRNAs, signaling molecules able to coordinate inflammatory responses in various physiological processes. Here, we provide evidence for a positive involvement of TEs in inflammation-driven bone repair and mineralization. In newly fractured mice bone, we observed an early transient upregulation of repeats occurring concurrently with the initiation of the inflammatory stage. In human bone biopsies, analysis revealed a significant correlation between repeats expression, mechanical stress and bone mineral density. We investigated a potential link between LINE-1 (L1) expression and bone mineralization by delivering a synthetic L1 RNA to osteoporotic patient-derived mesenchymal stem cells and observed a dsRNA-triggered protein kinase (PKR)-mediated stress response that led to strongly increased mineralization. This response was associated with a strong and transient inflammation, accompanied by a global translation attenuation induced by eIF2α phosphorylation. We demonstrated that L1 transfection reshaped the secretory profile of osteoblasts, triggering a paracrine activity that stimulated the mineralization of recipient cells.

Multiplexing strategies for large-scale proteomic analyses have become increasingly prevalent, TMT in particular. Here we used a large iPSC proteomic experiment with twenty-four 10-plex TMT batches to evaluate the effect of integrating multiple TMT batches within a single analysis. We reveal a significant inflation rate of missing protein and peptide values and show that precision decreases as multiple batches are integrated. Additionally, we explore the effect of false positives using Y chromosome specific peptides as an internal control to quantify the effect of co-isolation interference, as well as primary and secondary reporter ion interference. Based on the results we suggest solutions to mitigate these effects. We show using a reference line can increase precision by normalising the quantification across batches and we propose experimental designs that minimise the effect of cross population reporter ion interference.

Membraneless organelles are platforms for many aspects of RNA biology including small non-coding RNA (ncRNA) mediated gene silencing. How small ncRNAs utilise phase separated environments for their function is unclear. To address this question, we investigated how the PIWI-interacting RNA (piRNA) pathway engages with the membraneless organelle P granule in Caenorhabditis elegans. Proteomic analysis of the PIWI protein PRG-1 revealed an interaction with the constitutive P granule protein DEPS-1. Furthermore we identified a novel motif on DEPS-1, PBS, which interacts directly with the Piwi domain of PRG-1. This protein complex forms intertwining ultrastructures to build elongated condensates in vivo. These sub-organelle ultrastructures depend on the Piwi-interacting motif of DEPS-1 and mediate piRNA function. Additionally, we identify a novel interactor of DEPS-1, EDG-1, which is required for DEPS-1 condensates to form correctly. We show that DEPS-1 is not required for piRNA biogenesis but piRNA function: deps-1 mutants fail to produce the secondary endo-siRNAs required for the silencing of piRNA targets. Our study reveals how specific protein-protein interactions drive the spatial organisation and function of small RNA pathways within membraneless organelles.

Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has enormous potential to provide improved cellular models of human disease. However, variable genetic and phenotypic characterisation of many existing iPSC lines limits their potential use for research and therapy. Here, we describe the systematic generation, genotyping and phenotyping of 522 open access human iPSCs derived from 189 healthy male and female individuals as part of the Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative (HipSci: http://www.hipsci.org). Our study provides a comprehensive picture of the major sources of genetic and phenotypic variation in iPSCs and establishes their suitability for use in genetic studies of complex human traits and cancer. Using a combination of genome-wide analyses we find that 5-25% of the variation in different iPSC phenotypes, including differentiation capacity and cellular morphology, arises from differences between individuals. We also assess the phenotypic effects of rare, genomic copy number mutations that are recurrently seen following iPSC reprogramming and present an initial map of common regulatory variants affecting the transcriptome of pluripotent cells in humans.

Abstract We introduce here a novel approach, termed time-segmented acquisition (Seg), to enhance the identification of peptides and proteins in trapped ion mobility spectrometry (TIMS)-Time of flight (TOF) mass spectrometry. Our method exploits the positive correlation between ion mobility values and liquid chromatography (LC) retention time to improve ion separation and resolution. By dividing the LC retention time into multiple segments and applying a segment-specific narrower ion mobility range within the TIMS tunnel, we achieved better separation and higher resolution of ion mobility. This resulted in a substantial increase in peptide identification. In comparison to conventional TIMS methods, which typically scan a static ion mobility range (either from 0.6 to 1.6 or from 0.85 to 1.3), the Seg method significantly enhances the identification of peptides, proteins and average sequence coverage per protein. These findings highlight the potential of the Seg method in expanding the capabilities of TIMS-TOF mass spectrometry, especially for peptide-focused analysis such as post-translational modifications and peptidomics.

ABSTRACT Methylation of carbon-5 of cytosines (m 5 C) is a post-transcriptional nucleotide modification of RNA with widespread distribution across organisms. m 5 C has been shown to participate in mRNA transport and maintain mRNA stability through its recognition by the reader proteins ALYREF and YBX1, respectively. We recently showed that m 5 C is required for Caenorhabditis elegans development and fertility under heat stress. To contribute to the understanding of how m 5 C and its oxidative derivatives mediate their functions, we developed RNA baits bearing modified cytosines in diverse structural contexts to pulldown potential readers in C. elegans . Our mass spectrometry analyses reveal unique binding proteins for each of the modifications. We validate our dataset by demonstrating that the nematode ALYREF homologues ALY-1 and ALY-2 preferentially bind m 5 C in vitro . The dataset presented here serves as an important scientific resource that will support the discovery of new functions of m 5 C and its derivatives.

Arabidopsis is an important model organism and the first plant with its genome sequenced. Knowledge from studying this species has either direct or indirect applications to agriculture and human health. Quantitative proteomics by data-independent acquisition (SWATH/DIA-MS) was recently developed and considered as a high-throughput targetedlike approach for accurate proteome quantitation. In this approach, a high-quality and comprehensive library is a prerequisite. Here, we generated a protein expression atlas of 10 organs of Arabidopsis and created a library consisting of 15,514 protein groups, 187,265 unique peptide sequences, and 278,278 precursors. The identified protein groups correspond to ~56.5% of the predicted proteome. Further proteogenomics analysis identified 28 novel proteins. We subsequently applied DIA-mass spectrometry using this library to quantify the effect of abscisic acid on Arabidopsis. We were able to recover 8,793 protein groups with 1,787 of them being differentially expressed which includes 65 proteins known to respond to abscisic acid stress. Mass spectrometry data are available via ProteomeXchange with identifier PXD012710 for data-dependent acquisition and PXD014032 for DIA analyses. View this table: