Abstract Ross River Virus and Barmah Forest Virus infections (alphaviruses) have short incubation periods and are transmitted to humans by mosquitoes. Mycobacterium ulcerans infection (Buruli ulcer) has a much longer incubation period and its mode of transmission is contested. We studied the relationship between month of notification of alphavirus infections and Buruli ulcer in the temperate Australian state of Victoria over the six-year period, 2017-2022. Using cross-correlation , a signal processing technique, we found that a five-month temporal shift in month of Buruli ulcer notification provided optimal alignment with month of alphavirus notification. This closely matches the previously determined 5-month Buruli ulcer incubation period. Inferred transmission of both conditions showed coordinated maxima in summer and autumn and coordinated minima in winter and spring. The close alignment in season of transmission of alphavirus infection and Buruli ulcer in Victoria supports mosquitoes as the primary local vector of M. ulcerans .

ABSTRACT Buruli ulcer (BU) is a neglected tropical disease caused by infection of subcutaneous tissue with Mycobacterium ulcerans . BU is commonly reported across rural regions of Central and West Africa but has been increasing dramatically in temperate southeast Australia around the major metropolitan city of Melbourne. Previous research has shown that Australian native possums are reservoirs of M. ulcerans and that they shed the bacteria in their fecal material (excreta). Field surveys show that locales where possums harbor M. ulcerans overlap with human cases of BU, raising the possibility of using possum excreta surveys to predict the risk of disease occurrence in humans. We thus established a highly structured 12-month possum excreta surveillance program across an area of 350 km 2 in the Mornington Peninsula area 70 km south of Melbourne, Australia. The primary objective of our study was to assess if M. ulcerans surveillance of possum excreta provided useful information for predicting future human BU case locations. Over two sampling campaigns in summer and winter, we collected 2282 possum excreta specimens of which 11% were PCR positive for M. ulcerans -specific DNA. Using the spatial scanning statistical tool SatScan , we observed non-random, co-correlated clustering of both M. ulcerans positive possum excreta and human BU cases. We next trained a statistical model with the Mornington Peninsula excreta survey data to predict the future likelihood of human BU cases occurring in the region. By observing where human BU cases subsequently occurred, we show that the excreta model performance was superior to a null model trained using the previous year’s human BU case incidence data (AUC 0.66 vs 0.55). We then used data unseen by the excreta-informed model from a new survey of 661 possum excreta specimens in Geelong, a geographically separate BU endemic area to the southwest of Melbourne, to prospectively predict the location of human BU cases in that region. As for the Mornington Peninsula, the excreta-based BU prediction model outperformed the null model (AUC 0.75 vs 0.50) and pinpointed specific locations in Geelong where interventions could be deployed to interrupt disease spread. This study highlights the One Health nature of BU by confirming a quantitative relationship between possum excreta shedding of M. ulcerans and humans developing BU. The excreta survey-informed modeling we have described will be a powerful tool for efficient targeting of public health responses to stop BU.

Background: Whole genome sequencing shows promise to improve the clinical management of tuberculosis, but bioinformatic tools tailored for clinical reporting and suitable for accreditation to ISO standards are currently lacking. Methods: We developed tbtAMR, a comprehensive pipeline for analysis of Mycobacterium tuberculosis genomic data, including inference of phenotypic susceptibility and lineage calling from both solid and broth (MGIT) cultures. We used local and publicly-availably real-world data (phenotype and genotype) and synthetic genomic data to determine the appropriate quality control metrics and extensively validate the pipeline for clinical use. We combined and curated the large global databases of resistance mutations, fine-tuned for clinical purposes, by minimising false-positives whilst maintaining accuracy. Findings: tbtAMR accurately predicted lineages and phenotypic susceptibility for first- and second-line drugs, including from broth (MGIT) cultures. We designed and implemented a reporting template suitable for clinical and public health users and accredited the pipeline to ISO standards. Interpretation: The tbtAMR pipeline is accurate and fit-for-purpose for clinical and public health uses. Report templates, validation methods and datasets are provided here to offer a pathway for laboratories to adopt and seek their own accreditation for this critical test, to improve the management of tuberculosis globally. Funding: No specific funding was received for this study.

Background Buruli ulcer (BU) is a subcutaneous necrotic infection of the skin caused by Mycobacterium ulcerans. There has been increasing BU incidence in Victoria, Australia. The aim of this study to provide an epidemiological update of BU cases in Victoria to understand the pattern of distribution over time and space and attempt to identify local risk factors. Methods A comprehensive descriptive epidemiological analyses were performed on BU notification data from 1994 to 2016. In addition, retrospective temporal, spatial and spatio-temporal analyses were conducted to understand the distribution of cases. Quantum GIS was used to generate maps. Demographic, new housing settlements and historical rainfall data were analysed to assess their effects on BU incidence in Victoria. Findings There were a total of 902 patients notified from 1994-2016. The incidence rate was 0.8/100,000 persons in Victoria. Space and time analyses showed that the most likely disease cluster was the Bellarine and Mornington Peninsulas with incidence rate 50 times higher than the State of Victoria rate. Gender was not a risk factor, but age was, with increased susceptibility among the over 60 year old group. There was an unusual high risk in the 15-24 age group in Point Lonsdale. Correlation analyses indicated that increase in population and construction of new settlements might be some of the reasons contributing to the rise in cases in Victoria. Interpretation The findings agreed with published works in Australia of the increase in BU cases in Victoria. However, our findings also highlights the endemic nature of cases. The identified spatial disease clusters could be relevant for future environmental sampling studies or screening tests for M. ulcerans exposure.

In temperate southeastern Australia over the past two decades there has been a marked progressive increase in human cases of Buruli ulcer, an infection of subcutaneous tissue caused by Mycobacterium ulcerans. Native possums are the major local environmental reservoir of M. ulcerans as they not only develop Buruli lesions but they also shed M. ulcerans in their excreta. However the way humans acquire M. ulcerans from possums has not been determined. Previous case-control studies, insect field surveys and vector competence studies have suggested a role for mosquitoes in M. ulcerans transmission between possums and humans. To explore these links we conducted an extensive, 4-month structured mosquito field survey and four ad hoc field surveys across an area of 350km2 on the Mornington Peninsula, an area endemic for Buruli ulcer to the south of the major metropolitan city of Melbourne. We then compared spatial and temporal patterns of M. ulcerans-positive mosquito occurrence with M. ulcerans-positive possums (established by previous possum excreta surveys) and human Buruli ulcer cases across the region. We used metabarcoding to assess mosquito blood-feeding host preference and to reconstruct M. ulcerans genomes from positive mosquitoes to test epidemiological inferences. We collected 66,325 mosquitoes spanning 26 different species from 180 repeatedly sampled traps over a 4-month period. Culex molestus and Aedes notoscriptus were the dominant species (42% and 35% of trapped mosquitoes, respectively). PCR screening 25% of trapped mosquitoes revealed a significant association between M. ulcerans and Ae. notoscriptus (p<0.0001) with a maximum likelihood estimate (MLE) of 5.88 M. ulcerans positive mosquitoes per 1,000 tested. Using spatial scanning statistics, we also observed significant overlap between clusters of M. ulcerans-positive Ae. notoscriptus, M. ulcerans-positive possum excreta and human Buruli ulcer cases. Metabarcoding analyses of blood-fed Ae. notoscriptus showed individual mosquitoes had fed both on humans and native possums. Enrichment genome sequencing from PCR-positive mosquitoes confirmed shared M. ulcerans genome single-nucleotide polymorphism (SNP) profiles between mosquitoes, possum excreta and clinical human isolates within the same regions. These findings indicate that Ae. notoscriptus likely transmit M. ulcerans in southeastern Australia and highlight mosquito control as a plausible means to control the Buruli ulcer epidemic in our region.