Abstract Neuroblastoma is an embryonal childhood cancer that arises from aberrant development of the neural crest, mostly within the fetal adrenal medulla. It is not established what developmental processes neuroblastoma cancer cells represent. Here, we sought to reveal the phenotype of neuroblastoma cancer cells by comparing cancer (n=16,591) with fetal adrenal single cell transcriptomes (n=57,972). Our principal finding was that the neuroblastoma cancer cell resembled fetal sympathoblasts, but no other fetal adrenal cell type. The sympathoblastic state was a universal feature of neuroblastoma cells, transcending cell cluster diversity, individual patients and clinical phenotypes. We substantiated our findings in 652 neuroblastoma bulk transcriptomes and by integrating canonical features of the neuroblastoma genome with transcriptional signals. Overall, our observations indicate that there exists a pan-neuroblastoma cancer cell state which may be an attractive target for novel therapeutic avenues.

ABSTRACT Pediatric patients with high-risk neuroblastoma have poor survival rates and urgently need more effective treatment options with less side effects. As novel and improved immunotherapies may fill this need, we dissected the immunoregulatory interactions in neuroblastoma by single-cell RNA-sequencing of 25 tumors (10 pre- and 15 post-chemotherapy, including 5 pairs) to identify strategies for optimizing immunotherapy efficacy. Neuroblastomas were infiltrated by NK, T and B cells, and immunosuppressive myeloid populations. NK cells showed reduced cytotoxicity and T cells had a dysfunctional profile. Interaction analysis revealed a vast immunoregulatory network and identified NECTIN2-TIGIT as a crucial immune checkpoint. Combined blockade of TIGIT and PD-L1 significantly reduced neuroblastoma growth, with complete responses in vivo . Moreover, addition of TIGIT blockade to standard relapse treatment in a chemotherapy-resistant Th - ALK F1174L / MYCN 129/SvJ syngeneic model significantly improved survival. Concluding, our integrative analysis of neuroblastoma’s vast immunoregulatory network provides novel targets and a rationale for immunotherapeutic combination strategies.

SUMMARY Hepatoblastoma, the most prevalent pediatric liver cancer, almost always carries a WNT-activating CTNNB1 mutation, yet exhibits notable molecular heterogeneity. To characterize this heterogeneity and identify novel targeted therapies, we performed comprehensive analysis of hepatoblastomas and tumor-derived organoids using single-cell RNA-seq, spatial transcriptomics, single-cell ATAC-seq and high throughput drug profiling. We identified two distinct tumor epithelial signatures: hepatic ‘fetal-like’ and WNT-high ‘embryonal-like’ signatures, displaying divergent WNT signaling patterns. The liver-specific WNT targets were enriched in the fetal-like group, while the embryonal-like group was enriched in canonical WNT target genes. Gene regulatory network analysis revealed enrichment of regulons related to hepatic function such as bile acid, lipid and xenobiotic metabolism in the fetal-like subgroup but not in the embryonal-like subgroup. In addition, the dichotomous expression pattern of the transcription factors HNF4A and LEF1 allowed for a clear distinction between the fetal- and embryonal-like tumors. We also performed high-throughput drug screening using patient-derived tumor organoids and identified sensitivity to multiple inhibitor classes, most notably HDAC inhibitors. Intriguingly, embryonal-like tumor organoids, but not fetal-like tumor organoids, were sensitive to FGFR inhibitor treatments, suggesting a dependency on FGFR signaling. In summary, our data uncover the molecular and drug sensitivity landscapes of hepatoblastoma and pave the way for the development of targeted therapies.

Abstract Translocation renal cell carcinoma (tRCC) is a rare, aggressive type of kidney cancer primarily occurring in children. They are genetically defined by translocations involving MiT/TFE gene family members, TFE3 or, in rare cases, TFEB. The biology underlying tRCC development remains poorly understood, partly due to the lack of representative experimental models. Here, we utilized human kidney organoids, or tubuloids, to engineer a tRCC model by expression of one of the most common MiT/TFE fusions, SFPQ-TFE3. Fusion expressing tubuloids adopt a tRCC-like phenotype and gene expression signature in vitro and grow as clear cell RCC upon xenotransplantation in mice. Genome-wide binding analysis reveals that SFPQ-TFE3 reprograms gene expression signatures by aberrant, gain-of-function genome-wide DNA binding. Combining these analyses with single-cell mRNA readouts reveals an epithelium-to-mesenchymal differentiation trajectory underlying tRCC transformation, potentially caused by deregulated Wnt signaling. Our study demonstrates that SFPQ-TFE3 expression is sufficient to transform kidney epithelial cells into tRCC and defines the trajectories underlying malignant transformation, thereby facilitating the development of new therapeutic interventions.

Genetic interactions, a phenomenon whereby combinations of mutations lead to unexpected effects, reflect how cellular processes are wired and play an important role in complex genetic diseases. Understanding the molecular basis of genetic interactions is crucial for deciphering pathway organization as well as understanding the relationship between genetic variation and disease. Several putative molecular mechanisms have been linked to different genetic interaction types. However, differences in genetic interaction patterns and their underlying mechanisms have not yet been compared systematically between different functional gene classes. Here, differences in the occurrence and types of genetic interactions are compared for two classes, gene-specific transcription factors (GSTFs) and signaling genes (kinases and phosphatases). Genome-wide gene expression data for 63 single and double deletion mutants in baker's yeast reveals that the two most common genetic interaction patterns are buffering and inversion. Buffering is typically associated with redundancy and is well understood. In inversion, genes show opposite behavior in the double mutant compared to the corresponding single mutants. The underlying mechanism is poorly understood. Although both classes show buffering and inversion patterns, the prevalence of inversion is much stronger in GSTFs. To decipher potential mechanisms, a Petri Net modeling approach was employed, where genes are represented as nodes and relationships between genes as edges. This allowed over 9 million possible three and four node models to be exhaustively enumerated. The models show that a quantitative difference in interaction strength is a strict requirement for obtaining inversion. In addition, this difference is frequently accompanied with a second gene that shows buffering. Taken together, these results provide a mechanistic explanation for inversion. Furthermore, the ability of transcription factors to differentially regulate expression of their targets provides a likely explanation why inversion is more prevalent for GSTFs compared to kinases and phosphatases.

Abstract Protein-DNA interactions are dynamic and these dynamics are an important aspect of chromatin-associated processes such as transcription or replication. Due to a lack of methods to study on- and off-rates across entire genomes, protein-DNA interaction dynamics have not been studied extensively. Here we determine in vivo off-rates for the Saccharomyces cerevisiae chromatin organising factor Abf1, at 191 sites simultaneously across the yeast genome. Average Abf1 residence times span a wide-range, varying between 4.5 and 37 minutes. Sites with different off-rates are associated with different functional characteristics. This includes their transcriptional dependency on Abf1, nucleosome positioning and the size of the nucleosome-free region, as well as the ability to roadblock RNA polymerase II for termination. The results show how off-rates contribute to transcription factor function and that DIVORSEQ (Determining In Vivo Off-Rates by SEQuencing) is a meaningful way of investigating protein-DNA binding dynamics genome-wide.