SUMMARY Hepatoblastoma, the most prevalent pediatric liver cancer, almost always carries a WNT-activating CTNNB1 mutation, yet exhibits notable molecular heterogeneity. To characterize this heterogeneity and identify novel targeted therapies, we performed comprehensive analysis of hepatoblastomas and tumor-derived organoids using single-cell RNA-seq, spatial transcriptomics, single-cell ATAC-seq and high throughput drug profiling. We identified two distinct tumor epithelial signatures: hepatic ‘fetal-like’ and WNT-high ‘embryonal-like’ signatures, displaying divergent WNT signaling patterns. The liver-specific WNT targets were enriched in the fetal-like group, while the embryonal-like group was enriched in canonical WNT target genes. Gene regulatory network analysis revealed enrichment of regulons related to hepatic function such as bile acid, lipid and xenobiotic metabolism in the fetal-like subgroup but not in the embryonal-like subgroup. In addition, the dichotomous expression pattern of the transcription factors HNF4A and LEF1 allowed for a clear distinction between the fetal- and embryonal-like tumors. We also performed high-throughput drug screening using patient-derived tumor organoids and identified sensitivity to multiple inhibitor classes, most notably HDAC inhibitors. Intriguingly, embryonal-like tumor organoids, but not fetal-like tumor organoids, were sensitive to FGFR inhibitor treatments, suggesting a dependency on FGFR signaling. In summary, our data uncover the molecular and drug sensitivity landscapes of hepatoblastoma and pave the way for the development of targeted therapies.

ABSTRACT Homozygous inactivation of the CDKN2A locus is one of the most common genomic aberrations in human cancer. The locus codes for two unrelated and distinctly regulated proteins: p14ARF and p16INK4a, which inhibit MDM2 and CDK4/6, respectively. Loss of CDKN2A is also a recurrent event in relapsed neuroblastoma, a childhood tumour that arises from neural crest cells. To examine the consequences of the loss of the two distinct gene transcripts in neuroblastoma, we used the CRISPR-Cas9 system to knockout p14, p16 and p14 + p16 in SY5Y cells. RNA sequencing of the transcriptome revealed a striking shift towards an immature Schwann cell precursor-like phenotype with mesenchymal characteristics, specifically in the p16 and p14 + p16 knockouts. High-throughput drug screening of p16 and p14 + p16 knockout clones identified a large increase in sensitivity to EGFR inhibitors. On protein level, we were able to confirm that EGFR pathway activation is higher in p14 + p16 knockout cells and that treatment with the EGFR inhibitor afatinib resulted in higher levels of apoptosis. Afatinib also reduced tumour growth in vivo in xenografts transplanted with p14 + p16 knockout SY5Y cells. Overall, our study suggests that CDKN2A deletion in neuroblastoma relates to a phenotypic shift towards a more progenitor like state and increases sensitivity to EGFR inhibitors.

Summary Rhabdomyosarcomas (RMS) are mesenchyme-derived tumors and the most common childhood soft tissue sarcomas. Treatment is intense, with a nevertheless poor prognosis for high-risk patients. Discovery of new therapies would benefit from additional preclinical models. Here we describe the generation of a collection of pediatric RMS tumor organoid (tumoroid) models comprising all major subtypes. For aggressive tumors, tumoroid models can often be established within four to eight weeks, indicating the feasibility of personalized drug screening. Molecular, genetic and histological characterization show that the models closely resemble the original tumors, with genetic stability over extended culture periods of up to six months. Importantly, drug screening reflects established sensitivities and the models can be modified by CRISPR/Cas9 with TP53 knockout in an embryonal RMS model resulting in replicative stress drug sensitivity. Tumors of mesenchymal origin can therefore be used to generate organoid models, relevant for a variety of preclinical and clinical research questions.

CRISPR gene therapy holds the potential to cure a variety of genetic diseases by targeting causative mutations and introducing double stranded DNA breaks, subsequently allowing the host DNA repair mechanisms to introduce mutations. One option to introduce precise gene corrections is via the homology-directed repair (HDR) pathway. HDR can introduce a range of desired mutations dictated by a DNA template which holds a corrected DNA sequence which is written into the targeted gene. The problem in utilizing this pathway is that CRISPR-induced double stranded DNA breaks are repaired more often through the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which does not use a designed template and introduces random DNA damage in the form of insertions and deletions at the cut site. Since HDR activation depends on many interconnected processes in the cell, we aimed to screen a small library of drug compounds in clinical use or clinical development for cancer, to steer the DNA repair process towards preferential HDR activation. We included compounds in our screen based on three relevant mechanisms in CRISPR gene editing: the cell cycle, DNA repair processing and chromosomal packing. We included forty compounds, based on these criteria, screened their toxicity and dosed them in sub-toxic concentrations in cells during genome editing. Of these forty compounds we identified nine potential hits to have an effect on preferential activation of the HDR pathway over NHEJ. Alisertib, rucaparib and belinostat revealed a significant and major effect on gene editing pathway selection in further validation. Alisertib, an Aurora kinase A inhibitor, showed a particularly strong effect towards improving HDR over NHEJ. We subsequently investigated this effect at the genetic level and in a murine hepatoma cell line, which corroborated the initial findings. Alisertib led to an over 4-fold increase in preferential gene correction over gene knock-out, at a dose of 0.3 micromolar. However, the observations that Aurora kinase A inhibitors show considerable cytotoxicity (<50% cell viability) and can induce morphological changes at this concentration pose a limitation for the direct use of these inhibitors as HDR enhancers. However these findings do implicate that the pathways mediated by Aurora kinase A strongly influence HDR outcomes, which warrants further investigation into the downstream pathways driving this effect.