The specificities of 65 compounds reported to be relatively specific inhibitors of protein kinases have been profiled against a panel of 70–80 protein kinases. On the basis of this information, the effects of compounds that we have studied in cells and other data in the literature, we recommend the use of the following small-molecule inhibitors: SB 203580/SB202190 and BIRB 0796 to be used in parallel to assess the physiological roles of p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) isoforms, PI-103 and wortmannin to be used in parallel to inhibit phosphatidylinositol (phosphoinositide) 3-kinases, PP1 or PP2 to be used in parallel with Src-I1 (Src inhibitor-1) to inhibit Src family members; PD 184352 or PD 0325901 to inhibit MKK1 (MAPK kinase-1) or MKK1 plus MKK5, Akt-I-1/2 to inhibit the activation of PKB (protein kinase B/Akt), rapamycin to inhibit TORC1 [mTOR (mammalian target of rapamycin)–raptor (regulatory associated protein of mTOR) complex], CT 99021 to inhibit GSK3 (glycogen synthase kinase 3), BI-D1870 and SL0101 or FMK (fluoromethylketone) to be used in parallel to inhibit RSK (ribosomal S6 kinase), D4476 to inhibit CK1 (casein kinase 1), VX680 to inhibit Aurora kinases, and roscovitine as a pan-CDK (cyclin-dependent kinase) inhibitor. We have also identified harmine as a potent and specific inhibitor of DYRK1A (dual-specificity tyrosine-phosphorylated and -regulated kinase 1A) in vitro. The results have further emphasized the need for considerable caution in using small-molecule inhibitors of protein kinases to assess the physiological roles of these enzymes. Despite being used widely, many of the compounds that we analysed were too non-specific for useful conclusions to be made, other than to exclude the involvement of particular protein kinases in cellular processes.

Article1 June 2003free access MSK2 and MSK1 mediate the mitogen- and stress-induced phosphorylation of histone H3 and HMG-14 Ana Soloaga Ana Soloaga MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Stuart Thomson Stuart Thomson Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Giselle R. Wiggin Giselle R. Wiggin MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Navita Rampersaud Navita Rampersaud Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Mark H. Dyson Mark H. Dyson Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Catherine A. Hazzalin Catherine A. Hazzalin Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Louis C. Mahadevan Louis C. Mahadevan Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author J.Simon C. Arthur Corresponding Author J.Simon C. Arthur MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Ana Soloaga Ana Soloaga MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Stuart Thomson Stuart Thomson Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Giselle R. Wiggin Giselle R. Wiggin MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Navita Rampersaud Navita Rampersaud Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Mark H. Dyson Mark H. Dyson Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Catherine A. Hazzalin Catherine A. Hazzalin Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author Louis C. Mahadevan Louis C. Mahadevan Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK Search for more papers by this author J.Simon C. Arthur Corresponding Author J.Simon C. Arthur MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Author Information Ana Soloaga1, Stuart Thomson2, Giselle R. Wiggin1, Navita Rampersaud2, Mark H. Dyson2, Catherine A. Hazzalin2, Louis C. Mahadevan2 and J.Simon C. Arthur 1 1MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK 2Nuclear Signalling Laboratory, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QU UK *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2003)22:2788-2797https://doi.org/10.1093/emboj/cdg273 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Cells respond to mitogenic or stress stimuli by the rapid induction of immediate-early (IE) genes, which occurs concomitantly with the phosphorylation of histone H3 and the high-mobility-group protein HMG-14. In mammalian cells this response is mediated via ERK and p38 MAP kinase pathways, but the identity of the downstream kinase that phosphorylates histone H3 has been contentious. One study, based on Coffin–Lowry cells defective in RSK2, reported that RSK2 was the histone H3 kinase, while a second study, based on the efficiency of RSKs and MSKs as in vitro histone H3 kinases, and their relative susceptibility to kinase inhibitors, suggested that MSKs were responsible. We show here that the histone H3 phosphorylation response is normal in Coffin–Lowry cells. Further more, we show that histone H3 and HMG-14 phosphorylation is severely reduced or abolished in mice lacking MSK1 and MSK2. We also show that, despite this, histone H3 acetylation is unimpaired in these cells and that IE genes can be induced, although at a reduced efficiency. We conclude that MSKs are the major kinases for histone H3 and HMG-14 in response to mitogenic and stress stimuli in fibroblasts. Introduction Immediate-early (IE) genes form a class characterized by rapid but transient gene activation as a direct and primary response to intracellular signalling cascades. Their rapid induction by diverse stimuli is associated with the delivery of intracellular signals to transcription factors and co-activators at regulatory elements associated with these genes, as well as to nucleosomes present both at the promoter and within the transcribed region of these genes (Hazzalin and Mahadevan, 2002). This modification of nucleosome proteins has been suggested to help regulate the remodelling of chromatin structure (Mizzen and Allis, 1998) or to form a recognition motif allowing interaction with other proteins of the transcription machinery (Strahl and Allis, 2000; Jenuwein and Allis, 2001; Turner, 2002). Nucleosomal modification at inducible genes has been studied in systems ranging from yeast to mammalian cells, and those linked to gene expression include acetylation of lysines in histones H3 and H4 (Roth et al. 2001), phosphorylation of histone H3 on Ser10 (Davie and Spencer, 1999; Cheung et al., 2000a,b; Clayton et al., 2000; Thomson et al., 2001) and methylation of lysines and arginines in histones H3 and H4 (Zhang and Reinberg, 2001; Bauer et al., 2002; Santos-Rosa et al., 2002). In mammalian cells, chromatin immunoprecipitation (ChIP) studies show that, for rapidly inducible gene systems, there is clear evidence of enhanced histone H3 and H4 acetylation both at the promoters and within the body of genes upon transcriptional activation (Chen et al., 1999; Cheung et al., 2000a,b; Shang et al., 2000; Thomson et al., 2001). In addition, for NF-κB- and MAP-kinase-mediated gene induction, Ser10 phosphorylation of histone H3 has been shown to occur on nucleosomes at the promoter and/or within the body of activated genes (Cheung et al., 2000c; Li et al., 2001; Thomson et al., 2001; Saccani et al., 2002). Furthermore, using antibodies that recognize histone tails modified on multiple residues, it has been shown that acetylation and phosphorylation can coexist on the same histone H3 tail, giving rise to phosphoacetylation of histone H3, recently shown to occur transiently on nucleosomes of the active c-fos and c-jun proto-oncogenes upon mitogenic or stress stimulation (Cheung et al., 2000c; Clayton et al., 2000; Thomson et al., 2001). [32P]phosphate-labelling studies of intact cells have also identified the nucleosome-binding high-mobility-group protein HMG-14 [revised nomenclature HMGN1(Bustin, 2001)] as a protein which is phosphorylated by the same stimuli that cause the phosphorylation of histone H3 (Barratt et al., 1994; Cano et al., 1995). In addition, HMG-14 phosphorylation is blocked by the same inhibitors that prevent phosphorylation of histone H3 (Hazzalin et al., 1996; Thomson et al., 1999). This suggests that the same signalling pathways and kinases mediate both histone H3 and HMG-14 phosphorylation events, collectively termed the ‘nucleosomal response’ (Thomson et al., 1999). However, whereas histone H3 phosphorylation has been shown to occur at IE gene nucleosomes, HMG-14 has been more problematic to tie down definitively to specific genes, and the recent demonstration of its very rapid movement in mammalian cells may explain this (Phair and Misteli, 2000). Although phosphorylation of histone H3 at IE genes is now proven, the precise identity of the kinase that phosphorylates it has been contentious. It is important to note that this mode of transient inducible phosphorylation is distinct from the more quantitative phosphorylation of bulk histone H3 seen during mitosis, a process that correlates with chromatin condensation and is mediated by Aurora B (Hsu et al., 2000; Murnion et al., 2001; Crosio et al., 2002). Early studies established that the nucleosomal response is mediated via the ERK or SAPK2/p38 MAP kinase pathways in response to mitogenic or stress stimuli (Thomson et al., 1999; Hazzalin and Mahadevan, 2002). However, as neither the histone H3 or HMG-14 phosphorylation sites are proline directed, a prerequisite for direct phosphorylation by MAP kinases, the nucleosomal response must be due to a kinase downstream of SAPK2/p38 or ERK1/2. The discovery of MSK1 and MSK2 as kinases located in the nucleus that are capable of being activated by either ERK1/2 or SAPK2/p38 (Deak et al., 1998) raised the possibility that MSKs might be the nucleosomal kinases; consistent with this, MSK1 has been shown to be a potent histone H3 and HMG-14 kinase in vitro. Furthermore, H89, a compound that can inhibit MSK1, blocks the nucleosomal response in intact cells. On this basis, MSKs have been proposed as the potential histone H3 and HMG-14 kinases, as strong a statement as the data then permitted (Thomson et al., 1999). However, one drawback with the use of H89 is that it is not specific for MSK1 and can also inhibit several other protein kinases, including PKA, p70S6K and RSK2 (Davies et al., 2000). Another kinase, RSK2, which lies downstream of only ERK1/2 and not SAPK2/p38, has been independently proposed to be the histone H3 kinase (Sassone-Corsi et al., 1999). This was based on the reported loss of EGF-, TPA- and UV-inducible histone H3 phosphorylation in human fibroblasts from Coffin–Lowry patients, which carry mutations that inactivate the RSK2 gene (Trivier et al., 1996), and it was supported by similar findings in mouse embryonic stem cells in which the RSK2 gene had been knocked out by homologous recombination (Sassone-Corsi et al., 1999). This finding was somewhat unexpected, as RSK2 lies downstream of ERKs, which are not strongly activated by stress, and yet histone H3 phosphorylation in response to UV radiation was reportedly affected in Coffin–Lowry cells. A major complication with the use of Coffin–Lowry cells is that the initial report that these cells were unable to phosphorylate CREB in response to EGF (De Cesare et al., 1998) is inconsistent with later work on both RSK2 and MSK mouse knockouts which together show that MSKs, and not RSK2, are the major CREB kinases downstream of MAP kinases in fibroblasts (Bruning et al., 2000; Wiggin et al., 2002). Thus, although inducible phosphorylation of histone H3 is widely accepted to be mediated via ERK1/2 and SAPK2/p38 MAP kinase cascades in mammalian cells, there remains some contention about the precise downstream kinase that executes this task. Inducible phosphorylation of histone H3 at Ser10 that correlates with gene activation has also been reported in Saccharomyces cerevisiae (Lo et al., 2001). Although MAP kinases themselves are conserved in yeast, their downstream kinases, the equivalents of MSK and RSK, do not occur, suggesting that this mode of delivery of signals to nucleosomes is of more recent evolutionary origin. The kinase SNF1 has been reported to function as the histone H3 kinase in yeast (Lo et al., 2001), implying a MAP-kinase-independent mode of eliciting inducible histone H3 phosphorylation in this organism. Furthermore, phosphorylation of histone H3 at heat shock loci during heat shock has also been reported in Drosophila, although the issue of the kinase involved was not addressed (Nowak and Corces, 2000). Jil-1, a kinase in Drosophila with some similarity to MSK and RSK, has been shown to phosphorylate histone H3, although this was not shown to be inducible and was described in connection with the maintainance of chromatin structure (Wang et al., 2001). Here, we establish conclusively the role of MSK1 and MSK2 as the mitogen- and stress-activated histone H3 and HMG-14 kinase using cells in which one or both of the MSK genes have been deleted. The virtually complete loss of the nucleosomal response in MSK1/MSK2 knockout cells did not result in detectable loss of histone H3 acetylation at IE genes. Some effects of the knockouts on IE gene induction were observed; however, these were found to be both gene- and stimuli-specific and may reflect a role for MSKs in the phosphorylation of transcription factors such as CREB and ATF1. We re-visited earlier studies of Coffin–Lowry cells (Sassone-Corsi et al., 1999) and found, contrary to this previous report, that there is no loss of inducible histone H3 phosphorylation in these cells. We conclude that the MSKs, particularly MSK2, but not RSK2, are the major histone H3 and HMG-14 kinases. Results The nucleosomal response in primary mouse fibroblasts The nucleosomal response has previously been studied in mouse and human immortalized cell lines, most extensively in C3H 10T1/2 mouse fibroblasts. Because this current study is based on the use of primary embryonic fibroblasts from mice carrying MSK deletions, we first established that fibroblasts derived from wild-type embryos showed normal histone H3 and HMG-14 phosphorylation in response to anisomycin and TPA and that their sensitivity to inhibitors of MAP kinase pathways was the same as described previously. In addition, we investigated a second site of phosphorylation, Ser28 on histone H3, first identified as a site of phosphorylation on condensed chromatin (Goto et al., 1999) and later as an inducible event upon stimulation with UV-B (Zhong et al., 2001). When primary embryonic fibroblasts prepared from wild-type mice were stimulated with anisomycin for 20 min, phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 was observed by immunoblotting using modification-specific antibodies (Figure 1A). These events were unaffected by prior incubation of the cells with PD 184352, an inhibitor of the classical MAP kinase cascade, but were blocked by SB 203580, a SAPK2/p38 inhibitor (Figure 1A), consistent with earlier studies in C3H 10T1/2 cells indicating that a kinase(s) downstream of SAPK2/p38 was responsible for these phosphorylation events in response to anisomycin (Hazzalin et al., 1996; Thomson et al., 1999). Figure 1.Phosphorylation of histone H3 and HMG-14 is blocked by inhibitors of MAP kinase pathways. Wild-type mouse embryonic fibroblasts were serum starved overnight and then treated with 500 ng/ml TSA for 4 h where indicated and/or with 10 μM SB 203580 or 5 μM PD 184352 for 1 h where indicated. Cells were then stimulated with (A) 10 μg/ml anisomycin for 20 min or (B) 400 ng/ml TPA for 20 min. Phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 were then examined by immunoblotting. Levels of total ERK1/2 were analysed by immuoblotting from the same lysates. Download figure Download PowerPoint We also checked that ERK-mediated signalling to nucleosomes in response to mitogens also occurred in these cells. TPA was chosen in preference to EGF, because the latter stimulates SAPK2/p38 as well as ERK1/ERK2 in mouse embryonic fibroblasts (Wiggin et al., 2002). TPA stimulated the phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 in wild-type cells, and this phosphorylation was blocked by prior incubation of the cells with PD 184352, but was unaffected by SB 203580. This indicated that, in response to TPA, the kinase(s) responsible for histone H3 and HMG-14 phosphorylation lies downstream of ERK1 and ERK2 (Figure 1B). Finally, we repeated earlier studies on the effect of enhancing histone acetylation on anisomycin- and TPA-stimulated nucleosomal phosphorylation events (Figure 1A and B, last four lanes). As expected, incubation of these cells with the histone deacetylase inhibitor TSA prior to stimulation did not alter the phosphorylation of HMG-14. As described previously, TSA did cause an apparent reduction in the phosphorylation of histone H3 on Ser10, probably resulting from the increased acetylation of histone H3 on adjacent lysines, suppressing recognition of phosphorylation at Ser10 by the antibody (Clayton et al., 2000). This suggests that co-localization of the two modifications to the same histone H3 tails under these conditions, an important feature of this response described in earlier studies, is preserved in these cells. In contrast, TSA treatment enhanced the signal seen with the antibody that recognizes histone H3 phosphorylated at Ser28, suggesting that increased acetylation may lead to increased phosphorylation of this site. It is possible that this arises because acetylation of Lys23 may enhance the recognition of phosphorylated Ser28 by this rabbit polyclonal antibody. However, all the Ser28 phosphorylation experiments described here have been repeated in C3H 10T1/2 fibroblasts using a different mouse monoclonal phospho-Ser28 antibody, with identical results (M.H.Dyson, S.Thomson, M.Inagaki, H.Goto and L.C.Mahadevan, data not shown). MSK1 and MSK2 are not involved in the mitotic phosphorylation of histone H3 As histone H3 phosphorylation is induced during mitosis, as well as after cellular stress or mitogenic stimulation, we first checked that mitotic histone phosphorylation occurred normally in fibroblasts lacking MSK1 and MSK2. Analysis of histone H3 phosphorylation on Ser10 by immunofluorescence showed that, in cells undergoing mitosis, the phosphorylation could clearly be seen in both wild-type and MSK1/MSK2 knockout cells. A small proportion of both wild-type and knockout cells also showed strong histone H3 phosphorylation associated with heterochromatin, characteristic of cells in late G2 that are about to enter mitosis (Figure 2). Interestingly, a small proportion of cells still showed this heterochromatin histone H3 staining after prolonged serum starvation, suggesting that starvation was not effective in arresting all the cells in G0. The presence of a proportion of cells in G2 after starvation was confirmed by FACS analysis of propidium iodide labelled fibroblasts (data not shown). Figure 2.Mitotic phosphorylation of wild-type and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts. Wild-type and MSK1/MSK2 knockout cells growing in serum were fixed and phosphorylation of histone H3 on Ser10 examined by immunofluorescence. DAPI staining of the nucleus is shown in blue, phospho-Ser10 histone H3 staining is shown in red. Phospho histone H3 staining of a cell in mitosis is indicated by an arrow, and histone H3 staining in late G2 is indicated by an asterisk. Download figure Download PowerPoint Anisomycin-induced phosphorylation of histone H3 and HMG-14 in MSK1 and MSK2 knockout and MSK1/2 double-knockout cells We next examined the role of MSK1 and MSK2 in the nucleosomal response induced by anisomycin. To eliminate any possibility of artefacts arising from antibody recognition issues due to multiple modifications of histone tails (Clayton et al., 2000), [32P]phosphate labelling of intact cells was used to compare the nucleosomal response in wild-type and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts, with C3H 10T1/2 mouse fibroblasts used as a positive control (Figure 3). Neither histone H3 nor HMG-14 were clearly phosphorylated in response to anisomycin in the MSK1/2 double-knockout cells. On longer exposures, a slight remnant of inducible histone H3 phosphorylation was seen, whereas the HMG-14 defect was always complete in MSK1/2 double-knockout cells. In contrast, inducible phosphate labelling of histone H3 and HMG-14 bands could clearly be seen in both wild-type primary fibroblasts and the C3H 10T1/2 positive controls (Figure 3A). Inducible phosphorylation of the ribosomal protein S6 occurred normally in the MSK1/MSK2 knockout cells in the same experiment, showing that other modes of intracellular signalling were normal in the double-knockout cells (Figure 3B). Figure 3.(A) Phosphorylation of histone H3 and HMG-14 is absent in MSK1/2 double-knockout cells. Wild-type and MSK1/2 knockout cells and C3H 10T1/2 cells were starved overnight and then labelled with [32P]phosphate (50 μCi/ml) for 3 h. Cells were then left untreated or stimulated with anisomycin (50 ng/ml) for 30 min. Crude nuclei were prepared and extracted with 1 M NaCl. Salt soluble proteins were run on 15% acid/urea polyacrylamide gels, Coomassie blue stained, dried down and exposed to X-ray film. The Coomassie stained gel is shown on the right and the corresponding autoradiograph on the left. (B) To analyse S6 phosphorylation, the salt-insoluble pellet was resuspended in 8 M urea and samples run on gels similar to (A). The Coomassie stained gel is shown on the right and the corresponding autoradiograph on the left. Download figure Download PowerPoint The site-specific phosphorylation of histone H3 and HMG-14 in knockout fibroblasts was also examined by immunoblotting. Stimulation of wild-type cells with 10 μg/ml anisomycin, a concentration that inhibits protein synthesis (Figure 4A), or 25 ng/ml, a concentration that does not (data not shown), resulted in phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 (Figure 4A). Expression of H3 (Figure 4) and HMG-14 (see Supplementary figure 1, available at the The EMBO Journal Online) was unaffected by the knockout of MSK1 and MSK2. Immunoprecipitation kinase assays show that MSK1 and MSK2 are both maximally activated at around 20 min in these cells, correlating well with the time course of the nucleosomal events (Figure 4B). Consistent with previous reports (Wiggin et al., 2002), no activity could be detected for MSK1 in MSK1 knockout cells or for MSK2 in MSK2 knockout cells using these assays (see Supplementary figure 2). In the MSK1/2 double-knockout cells, phosphorylation of histone H3 at both sites was severely affected. At Ser10, a clear and reproducible decrease in phosphorylation was seen upon anisomycin stimulation, whereas at Ser28, although markedly decreased, a slight phosphorylation response remained evident. In contrast, the double-knockout cells showed total loss of phosphorylation of Ser6 on HMG-14 (Figure 4A). Figure 4.Phosphorylation of histone H3 and HMG-14 in MSK1/MSK2 knockout cells by anisomycin. (A) Wild-type and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts were serum starved overnight and then stimulated with anisomycin (10 μg/ml) for the times indicated. Cells were lysed and analysed for anisomycin-induced phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 by immunoblotting. (B) MSK1 and MSK2 were assayed against Crosstide after immunoprecipitation from 0.5 mg of soluble protein lysate from wild-type cells. One unit of activity was defined as the amount of enzyme required to incorporate 1 nmol of phosphate into the substrate in 1 min. Six measurements were taken per time point, and error bars represent the SEM of these values. (C) Wild-type, MSK1, MSK2 and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts were serum starved overnight and then stimulated with 10 μg/ml anisomycin for 30 min. Cells were fixed and phosphorylation of histone H3 on Ser10 examined by immunofluorescence. DAPI staining of the nucleus is shown in blue, and phospho-Ser10 histone H3 staining is shown in red. (D) Wild-type, MSK1, MSK2 and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts were serum starved overnight, followed by treatment with 500 ng/ml TSA for 4 h where indicated. Cells were then stimulated with anisomycin (10 μg/ml) for 30 min. Cells were lysed and analysed for anisomycin-induced phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 by immunoblotting. Download figure Download PowerPoint The anisomycin-stimulated phosphorylation of histone H3 on Ser10 was also analysed by immunofluorescence (Figure 4C). In wild-type cells, anisomycin stimulated weak but diffuse phosphorylation of histone H3 on Ser10 in all the cells, which was easily distinguishable from the strong signal that occurred during mitosis or on the heterochromatin of late G2 cells about to enter mitosis (Figure 2). Histone H3 Ser10 phosphorylation was still stimulated by anisomycin in MSK1 knockout cells, but was absent in MSK2 and MSK1/2 double-knockout cells. The nucleosomal response in the single knockout cells was also examined by immunoblotting for histone H3 and HMG-14 phosphorylation (Figure 4D). Cells lacking MSK1 showed a slight decrease in these responses, whereas cells lacking MSK2 showed virtually complete loss of these events. This indicates that, for the anisomycin-stimulated nucleosomal response mediated via SAPK2/p38 MAP kinase, MSK2 was the major isoform required for phosphorylation of all these sites, with MSK1 playing a minor role. To confirm that the lack of histone H3 phosphorylation in MSK1/MSK2 knockout cells was due to the lack of MSK activity in these cells, GFP-tagged MSK2 was transfected into the double-knockout fibroblasts. Expression of GFP–MSK2 and histone H3 phosphorylation was then visualized by fluorescence microscopy (Figure 5). GFP–MSK2 was localized in the nucleus and, in unstimulated cells, did not result in the phosphorylation of histone H3 on Ser10 or Ser28. When cells were stimulated with anisomycin, the cells expressing GFP–MSK2 were able to phosphorylate histone H3 on Ser10 and Ser28, whereas no histone H3 phosphorylation was observed in the untransfected cells. Figure 5.Rescue of histone H3 phosphorylation by transfection of MSK2. MSK1/2 double-knockout cells were transfected with a construct encoding GFP-tagged MSK2. The cells were serum starved and then left unstimulated (A and C) or treated with 10 μg/ml anisomycin for 30 min (B and D). Cells were then fixed, and the expression of MSK2 and phosphorylation of histone H3 on Ser10 (A and B) or Ser28 (C and D) was determined by immunofluorescence. Histone H3 phosphorylation is shown in red, GFP–MSK2 in green and DNA (DAPI) in blue. Download figure Download PowerPoint TPA-stimulated phosphorylation of histone H3 and HMG-14 in MSK1 and MSK2 knockout and MSK1/2 double-knockout cells These cells were also used in similar experiments to discover whether the ERK-mediated nucleosomal response, using TPA as a stimulus, required either MSK1 or MSK2. In wild-type cells, stimulation with TPA resulted in phosphorylation of histone H3 on both Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6, which was maximal at 30 min, closely similar to the time course observed with anisomycin (Figure 6A). However, analysis of the activation of the individual kinases showed that, in contrast to anisomycin, where both kinases showed similar activation profiles, MSK1 was fully activated earlier than MSK2 by TPA (Figure 6B). Figure 6.Phosphorylation of histone H3 and HMG-14 in MSK1/MSK2 knockout cells by TPA. (A) Wild-type and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts were serum starved overnight and then stimulated with TPA (400 ng/ml) for the times indicated. Cells were lysed and analysed for TPA-induced phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 by immunoblotting. (B) MSK1 and MSK2 were assayed against Crosstide after immunoprecipitation from 0.5 mg of soluble protein lysate from wild-type cells. One unit of activity was defined as the amount of enzyme required to incorporate 1 nmol of phosphate into the substrate in 1 min. Six measurements were taken per time point, and error bars represent the SEM of these values. (C) Wild-type, MSK1, MSK2 and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts were serum starved overnight and then stimulated with 400 ng/ml TPA for 30 min. Cells were fixed and phosphorylation of histone H3 on Ser10 examined by immunofluorescence. DAPI staining of the nucleus is shown in blue, and phospho-Ser10 histone H3 staining is shown in red. (D) Wild-type, MSK1, MSK2 and MSK1/MSK2 knockout fibroblasts were serum starved overnight, followed by treatment with 500 ng/ml TSA for 4 h where indicated. Cells were then stimulated with TPA (400 ng/ml) for 30 min. Cells were lysed and analysed for anisomycin-induced phosphorylation of histone H3 on Ser10 and Ser28 and of HMG-14 on Ser6 by immunoblotting. Download figure Download PowerPoint In the MSK1/2 double-knockout cells, TPA-stimulated phosphorylation of Ser10 on histone H3 was absent; if anything, the remaining histone H3 phosphorylation was slightly diminished compared with unstimulated controls. The phosphorylation of Ser28 was also substantially reduced in the double-knockout cells (Figure 6A). In addition, TPA-stimulated HMG-14 phosphorylation was totally lost in these cells, as observed with anisomycin. Analysis of the phosphorylation of histone H3 on Ser10 by immunofluorescence or of histone H3 (at Ser10 and Ser28) and HMG-14 by immunoblotting in single knockout cells showed that, while both MSK1 and MSK2 phosphorylated these proteins, the knockout of MSK2 had a greater effect than the knockout of MSK1 (Figure 6C and D). Histone H3 is phosphorylated in cells lacking RSK2 The analyses reported above indicate that MSKs are clearly the principal histone H3 and HMG-14 kinases in fibroblasts, conflicting with earlier reports that histone H3 phosphorylation is lost in Coffin–Lowry cells, implicating RSK2 as the principal histone H3 kinase (Sassone-Cors

Background: Protein kinase B (PKB), and the p70 and p90 ribosomal S6 kinases (p70 S6 kinase and p90 Rsk, respectively), are activated by phosphorylation of two residues, one in the 'T-loop' of the kinase domain and, the other, in the hydrophobic motif carboxy terminal to the kinase domain. The 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) activates many AGC kinases in vitro by phosphorylating the T-loop residue, but whether PDK1 also phosphorylates the hydrophobic motif and whether all other AGC kinases are substrates for PDK1 is unknown.Results: Mouse embryonic stem (ES) cells in which both copies of the PDK1 gene were disrupted were viable. In PDK1−/− ES cells, PKB, p70 S6 kinase and p90 Rsk were not activated by stimuli that induced strong activation in PDK1+/+ cells. Other AGC kinases — namely, protein kinase A (PKA), the mitogen- and stress-activated protein kinase 1 (MSK1) and the AMP-activated protein kinase (AMPK) — had normal activity or were activated normally in PDK1−/− cells. The insulin-like growth factor 1 (IGF1) induced PKB phosphorylation at its hydrophobic motif, but not at its T-loop residue, in PDK1−/− cells. IGF1 did not induce phosphorylation of p70 S6 kinase at its hydrophobic motif in PDK1−/− cells.Conclusions: PDK1 mediates activation of PKB, p70 S6 kinase and p90 Rsk in vivo, but is not rate-limiting for activation of PKA, MSK1 and AMPK. Another kinase phosphorylates PKB at its hydrophobic motif in PDK1−/− cells. PDK1 phosphorylates the hydrophobic motif of p70 S6 kinase either directly or by activation of another kinase.

AbstractUsing mouse knockouts for mitogen- and stress-activated protein kinase 1 (MSK1) and MSK2 and a double knockout of both MSK1 and MSK2, we show that these protein kinases are required for the stress-induced phosphorylation of transcription factors CREB and ATF1 in primary embryonic fibroblasts. In contrast mitogen-induced phosphorylation of CREB and ATF1 is greatly reduced but not totally abolished. The mitogen- and stress-induced phosphorylation of CREB at Ser133 has been linked to the transcription of several immediate early genes, including c-fos, junB, and egr1. The knockout of both MSK1 and MSK2 resulted in a 50% reduction in c-fos and junB gene transcription in response to anisomycin or UV-C radiation but only a small reduction in response to tetradecanoyl phorbol acetate or epidermal growth factor in fibroblasts. The transcription of egr1 in response to both mitogenic and stress stimuli, as well as stress-induced apoptosis, was unaffected in the MSK1/MSK2 double knockout. We thank Valeria Poli for help and advice on the generation of the mouse knockouts and Chris Armstrong and Jane Leitch for the production and purification of the antibodies used in this work. We thank The Sequencing Service (School of Life Sciences, University of Dundee, Scotland) for DNA sequencing.G.R.W. is the recipient of a postgraduate studentship from the United Kingdom Medical Research Council. This research was supported by grants from the Medical Research Council, Diabetes UK, The Royal Society, Astra-Zeneca, Boehringer-Ingelheim, GlaxoSmithKline, NovoNordisk, and Pfizer.

Significance Two types of ubiquitin chain are required to switch on one of the major signaling networks of the innate immune system that triggers the production of inflammatory mediators to combat infection by pathogens. This paper reports the unexpected discovery that both types of ubiquitin chain are attached covalently to one another and that the formation of one type of ubiquitin chain is dependent on the prior formation of the other. One function of these hybrid ubiquitin chains is to permit the colocalization of two different kinase complexes, thereby facilitating the activation of one kinase complex by the other to increase the speed of the response to infection.

Nearly every extracellular ligand that has been found to play a role in regulating bone biology acts, at least in part, through MAPK pathways. Nevertheless, much remains to be learned about the contribution of MAPKs to osteoblast biology in vivo. Here we report that the p38 MAPK pathway is required for normal skeletogenesis in mice, as mice with deletion of any of the MAPK pathway member–encoding genes MAPK kinase 3 (Mkk3), Mkk6, p38a, or p38b displayed profoundly reduced bone mass secondary to defective osteoblast differentiation. Among the MAPK kinase kinase (MAP3K) family, we identified TGF-β–activated kinase 1 (TAK1; also known as MAP3K7) as the critical activator upstream of p38 in osteoblasts. Osteoblast-specific deletion of Tak1 resulted in clavicular hypoplasia and delayed fontanelle fusion, a phenotype similar to the cleidocranial dysplasia observed in humans haploinsufficient for the transcription factor runt-related transcription factor 2 (Runx2). Mechanistic analysis revealed that the TAK1–MKK3/6–p38 MAPK axis phosphorylated Runx2, promoting its association with the coactivator CREB-binding protein (CBP), which was required to regulate osteoblast genetic programs. These findings reveal an in vivo function for p38β and establish that MAPK signaling is essential for bone formation in vivo. These results also suggest that selective p38β agonists may represent attractive therapeutic agents to prevent bone loss associated with osteoporosis and aging.

Abstract The Immunological Proteome Resource (ImmPRes ; http://immpres.co.uk/ ) is an open access public resource integrating proteomic data generated by large-scale mass-spectrometry analysis of murine hematopoietic populations. The initial focus is T lymphocytes and how their proteomes are shaped by immune activation, environment, and intracellular signalling pathways with an aim to expand it to B cells and innate immune cells. It is a multidisciplinary effort between immunology and mass spectrometry-based labs with the objective to help define an in-depth high-quality map of immune cell proteomes. Maintaining data reproducibility and integrity are a priority within the resource, thus there is an in-depth protocols section explaining in detail the sample processing and the mass spectrometry-based analysis. ImmPRes provides open access to proteomic datasets covering a wide range of murine leukocyte populations with analysis of copy numbers per cell of > 10,000 proteins, enabling new understanding of lymphocyte phenotypes. All data is accessible via a simple graphical interface that supports easy interrogation of the data and options to download data summaries and raw data files.

Abstract Heart failure is a leading cause of death that develops subsequent to deleterious hypertrophic cardiac remodelling. MAPK pathways play a key role in coordinating the induction of gene expression during hypertrophy. Induction of the immediate early gene (IEG) response is a necessary and early event in this process. How MAPK and IEG expression are coupled during cardiac hypertrophy is not yet resolved. Here, in vitro, in rodent models and in human samples, we demonstrate that MAPK-stimulated IEG induction depends on the Mitogen and Stress activated protein Kinase (MSK) and its phosphorylation of histone H3 at serine 28 (pH3S28). pH3S28 in IEG promoters in turn recruits Brg1, a BAF60 ATP-dependent chromatin remodelling complex component, initiating gene expression. Without MSK activity and IEG induction, the hypertrophic response is suppressed. These studies provide new mechanistic insights and highlight the role of signalling to the epigenome in gene expression regulation during cardiac hypertrophy. Brief summary one sentence MSK1/2 phosphorylation of Histone 3 Serine 28 couples MAPK signalling with chromatin remodelling and immediate early gene expression to induce pro-hypertrophic cardiac transcriptional responses.

Abstract Interleukin-13 (IL-13) and other Th2 cytokines are important regulators of airway hyper-responsiveness, immune cell infiltration and inflammation in allergic asthma, and are produced when immune cells, such as type 2 innate lymphoid cells (ILC2s) and mast cells, are stimulated with IL-33. Here, we report that the IL-33-dependent secretion of IL-13 from ILC2s is prevented by inhibition of the salt-inducible kinases (SIKs), as we have shown previously in mast cells (Darling NJ et al. , 2021, J. Biol. Chem. doi: 10.1016/j.jbc.2021.100428). We also report that a new SIK inhibitor with improved pharmacokinetic properties suppresses the recruitment of eosinophils to the lungs and serum immunoglobulin E (IgE) levels in the Alternaria alternata-induced model of allergic asthma. Our results suggest that drugs targeting SIK isoforms may have therapeutic potential for the treatment of asthma.

Data independent acquisition has seen breakthroughs that enable comprehensive proteome profiling using short gradients. As the proteome coverage continues to increase, the quality of the data generated becomes much more relevant. Using Spectronaut, we show that the default search parameters can be easily optimised to minimise the occurrence of false positives across different samples. Using an immunological infection model system to demonstrate the impact of adjusting search settings we analysed mouse macrophages and compared their proteome to macrophages spiked with Candida albicans. This experimental system enabled the identification of false positives since Candida albicans peptides and proteins should not be present in the mouse only samples. We show that adjusting the search parameters reduced false positive identifications by 89% at the peptide and protein level, thereby considerably increasing the quality of the data. We also show that these optimised parameters incur a moderate cost, only reducing the overall number of true positive identifications across each biological replicate by <6.7% at both the peptide and protein level. We believe the value of our updated search parameters extends beyond a two-organism analysis and would be of great value to any DIA experiment analysing heterogenous populations of cell types or tissues.