Abstract CC chemokine receptor 5 (CCR5) contributes to inflammatory responses by driving cell migration and scavenging chemokine to shape directional chemokine gradients. A drug against CCR5 has been approved for blocking HIV entry into cells. However, targeting CCR5 for the treatment of inflammatory diseases and cancer has had limited success because of the complex biology and pharmacology of this receptor. CCR5 is activated by many natural and engineered chemokines that elicit distinct receptor signaling and trafficking responses, including some that sequester the receptor inside the cell. The sequestration phenomenon may be therapeutically exploitable, but the mechanisms by which different ligands traffic CCR5 to different cellular locations are poorly understood. Here we employed live cell ascorbic acid peroxidase proximity labeling and quantitative mass spectrometry proteomics for unbiased discovery of temporally resolved protein neighborhoods of CCR5 following stimulation with its endogenous agonist, CCL5, and two CCL5 variants that promote intracellular retention of the receptor. Along with targeted pharmacological assays, the data reveals distinct ligand-dependent CCR5 trafficking patterns with temporal resolution. All three chemokines internalize CCR5 via β-arrestin- dependent, clathrin-mediated endocytosis but to different extents, with different kinetics and with varying dependencies on GPCR kinase subtypes. The agonists differ in their ability to target the receptor to lysosomes for degradation, as well as to the Golgi compartment and the trans-Golgi network, and these trafficking patterns translate into distinct levels of ligand scavenging. The results provide insight into the molecular mechanisms behind CCR5 intracellular sequestration and suggest actionable patterns for the development of chemokine-based CCR5 targeting molecules. Significance Statement CCR5 plays a crucial role in the immune system and is important in numerous physiological and pathological processes such as inflammation, cancer and HIV transmission. Along with its functional diversity, different CCR5 ligands can induce distinct receptor signaling responses and trafficking behaviors; the latter includes intracellular receptor sequestration which offers a potential therapeutic strategy for inhibiting CCR5 function. Using time-resolved proximity labeling proteomics and targeted pharmacological experiments, this study reveals the molecular basis for receptor sequestration including information that can be exploited for the development of CCR5 targeting molecules that promote retention of the receptor inside the cell.

Abstract Leukocyte recruitment from the vasculature into tissues is a crucial component of the immune system, but is also key to inflammatory disease. Chemokines are central to this process but have yet to be therapeutically targeted during inflammation, due to a lack of mechanistic understanding. Specifically, CXCL4 (PF4) has no established receptor that explains its function. Here we use biophysical, in vitro and in vivo techniques to determine the mechanism underlying CXCL4 mediated leukocyte recruitment. We demonstrate that CXCL4 binds to glycosaminoglycan (GAG) sugars within the endothelial extracellular matrix resulting in increased vascular permeability and non-specific recruitment of a range of leukocytes. Furthermore, GAG sulphation confers selectivity onto chemokine localisation. These findings represent a new understanding of chemokine biology, providing novel mechanisms for future therapeutic targeting. One sentence summary CXCL4 binds to extracellular matrix proteoglycans resulting in increased vascular permeability and recruitment of a wide range of different leukocytes via a non-canonical mechanism.

By driving monocyte chemotaxis, the chemokine receptor CCR2 shapes inflammatory responses and the formation of tumor microenvironments. This makes it a promising target in inflammation and immuno-oncology. Unfortunately, despite extensive efforts, no CCR2-targeting therapeutics have yet reached the clinic. Cited reasons include the redundancy of the chemokine system, suboptimal properties of compound candidates, and poor agreement of clinical responses with preclinical murine model studies. Structure-based drug design (SBDD) approaches can rationalize and greatly accelerate CCR2 compound discovery and optimization. The prerequisites for such efforts include a good atomic-level understanding of the molecular determinants of action of existing antagonists. In this study, using molecular docking and artificial intelligence- (AI-) powered compound library screening, we uncover the structural principles of small molecule antagonism and selectivity towards CCR2 and its sister receptor CCR5. We show that CCR2 orthosteric inhibitors universally occupy an inactive-state-specific tunnel between receptor helices 1 and 7; we also discover an unexpected role for an extra-helical groove accessible through this tunnel, suggesting its potential as a new targetable interface for CCR2 and CCR5 modulation. We implicate a single CCR2 residue, S101(2.63), as a determinant of CCR2/CCR5 and human/mouse antagonist selectivity, and corroborate its role through experimental gain-of-function mutagenesis. We systematically identify the binding determinants for various chemotypes of allosteric antagonists. We establish a critical role of induced fit in antagonist recognition, reveal strong chemotype selectivity of existing structures, and demonstrate the high predictive potential of a new deep-learning-based compound scoring function. Finally, we expand the available CCR2 structural landscape with computationally generated chemotype-specific models well-suited for structure-based antagonist design.