Measles virus (MeV) presents a public health threat that is escalating as vaccine coverage in the general population declines and as populations of immunocompromised individuals, who cannot be vaccinated, increase. There are no approved therapeutics for MeV. Neutralizing antibodies targeting viral fusion are one potential therapeutic approach but have not yet been structurally characterized or advanced to clinical use. We present cryo–electron microscopy (cryo-EM) structures of prefusion F alone [2.1-angstrom (Å) resolution], F complexed with a fusion-inhibitory peptide (2.3-Å resolution), F complexed with the neutralizing and protective monoclonal antibody (mAb) 77 (2.6-Å resolution), and an additional structure of postfusion F (2.7-Å resolution). In vitro assays and examination of additional EM classes show that mAb 77 binds prefusion F, arrests F in an intermediate state, and prevents transition to the postfusion conformation. These structures shed light on antibody-mediated neutralization that involves arrest of fusion proteins in an intermediate state.

Abstract The envelope glycoprotein GP of the ebolaviruses is essential for host cell attachment and entry. It is also the primary target of the protective and neutralizing antibody response in both natural infection and vaccination. GP is heavily glycosylated with up to 17 predicted N-linked sites, numerous O-linked glycans in its disordered mucin-like domain (MLD), and three predicted C-linked mannosylation sites. Glycosylation of GP is important for host cell attachment to cell-surface lectins, as well as GP stability and fusion activity. Moreover, it has been shown to shield GP from neutralizing activity of serum antibodies. Here, we use mass spectrometry-based glycoproteomics to profile the site-specific glycosylation patterns of ebolavirus GP. We detect up to 16 unique O-linked glycosylation sites in the mucin-like domain, as well as two O-linked sites in the head and glycan cap domains of the receptor-binding GP1 subunit. Multiple O-linked glycans are observed at the S/T residues of N-linked glycosylation sequons, suggesting possible crosstalk between the two types of modifications. We also confirmed the presence of C-mannosylation at W288 in the context of trimeric GP. We find heterogenous, complex N-linked glycosylation at the majority of predicted sites as expected. By contrast, the two conserved sites N257 and N563 are enriched in unprocessed high-mannose and hybrid glycans, suggesting a role in host-cell attachment via DC-SIGN/L-SIGN. We discuss our findings in the context of antibody recognition to show how glycans contribute to and restrict neutralization epitopes. This information on how N-, O-, and C-linked glycans together build the heterogeneous glycan shield of GP can guide future immunological studies and functional interpretation of ebolavirus GP-antibody interactions.

Abstract Monoclonal antibodies can provide important pre- or post-exposure protection against disease for those not yet vaccinated or in individuals that fail to mount a protective immune response after vaccination. A key concern in use of monotherapy monoclonal antibody products lies in the high risk of mutagenic escape. Inmazeb (REGN-EB3), a three-antibody cocktail against Ebola virus, demonstrated efficacy in lessening disease course and improving survival in a randomized, controlled trial. Here we present the cryoEM structure at 3.1 Å of the Ebola virus glycoprotein, determined without symmetry averaging, in a simultaneous complex with eight Fab fragments of antibodies in the Inmazeb cocktail. This structure allows modeling of previously disordered portions of the glycan cap, maps the non-overlapping epitopes of Inmazeb, and illuminates the basis for complementary activities, as well as residues that are critical for resistance to escape by each component of this cocktail and other clinically relevant antibodies. We also provide direct evidence that, unlike monotherapy treatments, including those targeting conserved epitopes, the Inmazeb protects against the rapid emergence of EBOV escape mutants and supports the benefit of the combination approach.

Filoviruses, including Ebola and Marburg viruses, are a family of highly lethal viruses that cause severe hemorrhagic fever in humans with near annual outbreaks. Antiviral options are limited, and broad-spectrum antivirals are needed. The core of the filamentous virion is formed by the nucleocapsid, a helical structure in which the polymerized nucleoprotein (NP) assembles on the RNA genome and is surrounded by viral proteins VP24 and VP351,2. The mechanism by which these proteins assemble to form nucleocapsids inside infected cells is unclear, and the identity of the outer half of nucleocapsid density remains unassigned. Using cryo-electron tomography, we revealed the assembly process of Ebola virus in both cells transfected with the viral proteins and cells infected with a biologically contained model Ebola virus. We obtained a fully assembled intracellular nucleocapsid-like structure at 9 Å that allows assignment of previously unassigned densities and presents the first complete model of the intracellular Ebola nucleocapsid. Our model reveals a previously unknown, third layer of additional copies of NP in complex with VP35. In this outer layer, the N-terminal domain of VP35 maintains NP in a monomeric form, and the rest of VP35 appears to participate in an intra-rung nucleocapsid interaction. The C-terminal region of NP lies outside this third outer layer, allowing localization and recruitment of additional viral proteins and connection of the nucleocapsid to the matrix beneath the virus envelope. Comparison of this in-cell nucleocapsid to previous in-virion structures reveals that the nucleocapsid helix condenses upon incorporation into the virion. Molecular interfaces responsible for nucleocapsid assembly are conserved among filoviruses, offering potential target sites for broadly effective antivirals. The architecture and assembly dynamics of Ebola virus nucleocapsids revealed here uncover a unique filovirus nucleocapsid assembly and a condensation mechanism that protect viral genome integrity in the virion.