ABSTRACT We have developed a generally applicable method based on CRISPR/Cas9-targeted ultra-long read sequencing (CTLR-Seq) to completely and haplotype-specifically resolve, at base-pair resolution, large, complex, and highly repetitive genomic regions that had been previously impenetrable to next-generation sequencing analysis such as large segmental duplication (SegDup) regions and their associated genome rearrangements that stretch hundreds of kilobases. Our method combines in vitro Cas9-mediated cutting of the genome and pulse-field gel electrophoresis to haplotype-specifically isolate intact large (200-550 kb) target regions that encompass previously unresolvable genomic sequences. These target fragments are then sequenced (amplification-free) to produce ultra-long reads at up to 40x on-target coverage using Oxford nanopore technology, allowing for the complete assembly of the complex genomic regions of interest at single base-pair resolution. We applied CTLR-Seq to resolve the exact sequence of SegDup rearrangements that constitute the boundary regions of the 22q11.2 deletion CNV and of the 16p11.2 deletion and duplication CNVs. These CNVs are among the strongest known risk factors for schizophrenia and autism. We then perform de novo assembly to resolve, for the first time, at single base-pair resolution, the sequence rearrangements of the 22q11.2 and 16p11.2 CNVs, mapping out exactly the genes and non-coding regions that are affected by the CNV for different carriers.

Detecting structural variants (SVs) from sequencing data is key to genome analysis, but methods using standard whole-genome sequencing (WGS) data are typically incapable of resolving complex SVs with multiple co-located breakpoints. We introduce the ARC-SV method, which uses a probabilistic model to detect arbitrary local rearrangements from WGS data. Our method performs well on simple SVs while surpassing state-of-the-art methods in complex SV detection.

Copy number variants (CNVs), either deletions or duplications, at the 16p11.2 locus in the human genome are known to increase the risk for autism spectrum disorders (ASD), schizophrenia, and for several other developmental conditions. Here, we investigate the global effects on gene expression and DNA methylation using a 16p11.2 CNV patient-derived induced pluripotent stem cell (iPSC) to induced neuron (iN) cell model system. This approach revealed genome-wide and cell-type specific alterations to both gene expression and DNA methylation patterns and also yielded specific leads on genes potentially contributing to some of the known 16p11.2 patient phenotypes. PCSK9 is identified as a possible contributing factor to the symptoms seen in carriers of the 16p11.2 CNVs. The protocadherin (PCDH) gene family is found to have altered DNA methylation patterns in the CNV patient samples. The iPSC lines used for this study are available through a repository as a resource for research into the molecular etiology of the clinical phenotypes of 16p11.2 CNVs and into that of neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders in general.

HepG2 is one of the most widely used human cell lines in biomedical research and one of the main cell lines of ENCODE. Although the functional genomic and epigenomic characteristics of HepG2 are extensively studied, its genome sequence has never been comprehensively analyzed and higher-order structural features of its genome beyond its karyotype were only cursorily known. The high degree of aneuploidy in HepG2 renders traditional genome variant analysis methods challenging and partially ineffective. Correct and complete interpretation of the extensive functional genomics data from HepG2 requires an understanding of the cell line's genome sequence and genome structure. We performed deep whole-genome sequencing, mate-pair sequencing and linked-read sequencing to identify a wide spectrum of genome characteristics in HepG2: copy numbers of chromosomal segments, SNVs and Indels (both corrected for copy-number), phased haplotype blocks, structural variants (SVs) including complex genomic rearrangements, and novel mobile element insertions. A large number of SVs were phased, sequence assembled and experimentally validated. Several chromosomes show striking loss of heterozygosity. We re-analyzed HepG2 RNA-Seq and whole-genome bisulfite sequencing data for allele-specific expression and phased DNA methylation. We show examples where deeper insights into genomic regulatory complexity could be gained by taking knowledge of genomic structural contexts into account. Furthermore, we used the haplotype information to produce an allele-specific CRISPR targeting map. This comprehensive whole-genome analysis serves as a resource for future studies that utilize HepG2.

We produced an extensive collection of deep re-sequencing datasets for the Venter/HuRef genome using the Illumina massively-parallel DNA sequencing platform. The original Venter genome sequence is a very-high quality phased assembly based on Sanger sequencing. Therefore, researchers developing novel computational tools for the analysis of human genome sequence variation for the dominant Illumina sequencing technology can test and hone their algorithms by making variant calls from these Venter/HuRef datasets and then immediately confirm the detected variants in the Sanger assembly, freeing them of the need for further experimental validation. This process also applies to implementing and benchmarking existing genome analysis pipelines. We prepared and sequenced 200 bp and 350 bp short-insert whole-genome sequencing libraries (sequenced to 100x and 40x genomic coverages respectively) as well as 2 kb, 5 kb, and 12 kb mate-pair libraries (43x, 97x, and 122x physical coverages respectively). Lastly, we produced a linked-read library (133x physical coverage) from which we also performed haplotype phasing.