Abstract Herbal compatibility is the knowledge of which herbs to combine in traditional Chinese medicine (TCM) formulations. The lack of understanding of herbal compatibility is one of the key problems for the application and popularization of TCM in western society. Because of the chemical complexity of herbal medicines, it is simpler to begin to conduct compatibility research based on herbs rather than component plant secondary metabolites. We have used transcriptome analysis to explore the effects and interactions of two plant extracts (Kushen and Baituling) combined in Compound Kushen Injection (CKI). Based on shared chemical compounds and in vitro cytotoxicity comparisons, we found that both the major compounds in CKI, and the cytotoxicity effects of CKI were mainly derived from the extract of Kushen ( Sophorae flavescentis ). We generated and analyzed transcriptome data from MDA-MB-231 cells treated with single-herb extracts or CKI and results showed that Kushen contributed to the perturbation of the majority of cytotoxicity/cancer related pathways in CKI such as cell cycle and DNA replication. We also found that Baituling ( Heterosmilax yunnanensis Gagnep ) could not only enhance the cytotoxic effects of Kushen in CKI, but also activate immune-related pathways. Our analyses predicted that IL-1 β gene expression was upregulated by Baituling in CKI and we confirmed that IL-1 β protein expression was increased using an ELISA assay. Altogether, these findings help to explain the rationale for combining Kushen and Baituling in CKI, and transcriptome analysis using single herb extracts is an effective method for understanding herbal compatibility in TCM.

We have used computational and experimental biology approaches to identify candidate mechanisms of action of a traditional Chinese medicine. Compound Kushen Injection (CKI), in a breast cancer cell line in which CKI causes apoptosis. Because CKI is a complex mixture of plant secondary metabolites, we used a high-performance liquid chromatography (HPLC) fractionation and reconstitution approach to define chemical fractions required for CKI to induce apoptosis in MDA-MB-231 cells. Our initial fractionation separated major from minor compounds, and showed that the major compounds accounted for little of the activity of CKI. By systematically perturbing the major compounds in CKI we found that removal of no single major compound could alter the effect of CKI on cell viability and apoptosis. However, simultaneous removal of two major compounds identified oxymatrine and oxysophocarpine as critical compounds with respect to CKI activity. We then used RNA sequencing and transcriptome analysis to correlate compound removal with gene expression and phenotype data. We determined that many compounds in CKI are required for its effectiveness in triggering apoptosis but that significant modulation of its activity is conferred by a small number of compounds. In conclusion, CKI may be typical of many plant based extracts that contain many compounds in that no single compound is responsible for all of the bioactivity of the mixture and that many compounds interact in a complex fashion to influence a network containing many targets.

Transposable Elements (TEs) are mobile DNA sequences that make up significant fractions of amniote genomes. However, they are difficult to detect and annotate ab initio because of their variable features, lengths and clade-specific variants. We have addressed this problem by refining and developing a Comprehensive ab initio Repeat Pipeline (CARP) to identify and cluster TEs and other repetitive sequences in genome assemblies. The pipeline begins with a pairwise alignment using krishna, a custom aligner. Single linkage clustering is then carried out to produce families of repetitive elements. Consensus sequences are then filtered for protein coding genes and then annotated using Repbase and a custom library of retrovirus and reverse transcriptase sequences. This process yields three types of family: fully annotated, partially annotated and unannotated. Fully annotated families reflect recently diverged/young known TEs present in Repbase. The remaining two types of families contain a mixture of novel TEs and segmental duplications. These can be resolved by aligning these consensus sequences back to the genome to assess copy number vs. length distribution. Our pipeline has three significant advantages compared to other methods for ab initio repeat identification: 1) we generate not only consensus sequences, but keep the genomic intervals for the original aligned sequences, allowing straightforward analysis of evolutionary dynamics, 2) consensus sequences represent low-divergence, recently/currently active TE families, 3) segmental duplications are annotated as a useful by-product. We have compared our ab initio repeat annotations for 7 genome assemblies (1 unpublished) to other methods and demonstrate that CARP compares favourably with RepeatModeler, the most widely used repeat annotation package.

The tuatara (Sphenodon punctatus), the only living member of the archaic reptilian order Rhynchocephalia (Sphenodontia) once widespread across Gondwana, is an iconic and enigmatic terrestrial vertebrate endemic to New Zealand. A key link to the now extinct stem reptiles from which dinosaurs, modern reptiles, birds and mammals evolved, the tuatara provides exclusive insights into the ancestral amniotes. The tuatara genome, at ~5 Gbp, is among the largest vertebrate genomes assembled. Analysis of this genome and comparisons to other vertebrates reinforces the uniqueness of the tuatara. Phylogenetic analyses indicate tuatara diverged from the snakes and lizards ~250 MYA. This lineage also shows moderate rates of molecular evolution, with instances of punctuated evolution. Genome sequence analysis identifies expansions of protein, non-protein-coding RNA families, and repeat elements, the latter of which show an extraordinary amalgam of reptilian and mammalian features. Sequencing of this genome provides a valuable resource for deep comparative analyses of tetrapods, as well as for tuatara biology and conservation. It also provides important insights into both the technical challenges and the cultural obligations associated with genome sequencing.

Background: Because Traditional Chinese Medicine (TCM) preparations are often combinations of multiple herbs containing hundreds of compounds, they have been difficult to study. Compound Kushen Injection (CKI) is a complex mixture cancer treatment used in Chinese hospitals for over twenty years. Purpose: To demonstrate that a systematic analysis of molecular changes resulting from complex mixtures of bioactives from TCM can identify a core set of differentially expressed (DE) genes and a reproducible set of candidate pathways. Study Design: We used a cancer cell culture model to measure the effect of CKI on cell cycle phases, apoptosis and correlate those phenotypes with CKI induced changes in gene expression. Methods: We treated cancer cells with CKI in order to generate and analyse high-throughput transcriptome data from two cancer cell lines. We integrated these differential gene expression results with previously reported results. Results: CKI induced cell-cycle arrest and apoptosis and altered the expression of 363 core candidate genes associated with cell cycle, apoptosis, DNA replication/repair and various cancer pathways. Of these, 7 are clinically relevant to cancer diagnosis or therapy and 14 are cell cycle regulators, and most of these 21 candidates are downregulated by CKI. Comparison of our core candidate genes to a database of plant medicinal compounds and their effects on gene expression identified one-to-one, one-to-many and many-to-many regulatory relationships between compounds in CKI and DE genes. Conclusions: By identifying promising candidate pathways and genes associated with CKI based on our transcriptome-based analysis, we have shown this approach is useful for the systematic analysis of molecular changes resulting from complex mixtures of bioactives. Keywords: Compound Kushen Injection, cancer cell, transcriptome, multiple targets, cell cycle, apoptosis

The factors guiding retrotransposon insertion site preference are not well understood. Different types of retrotransposons share common replication machinery and yet occupy distinct genomic domains. Autonomous long interspersed elements accumulate in gene-poor domains and their non-autonomous short interspersed elements accumulate in gene-rich domains. To determine genomic factors that contribute to this discrepancy we analysed the distribution of retrotransposons within the framework of chromosomal domains and regulatory elements. Using comparative genomics, we identified large-scale conserved patterns of retrotransposon accumulation across several mammalian genomes. Importantly, retrotransposons that were active after our sample-species diverged accumulated in orthologous regions. This suggested a conserved interaction between retrotransposon activity and conserved genome architecture. In addition, we found that retrotransposons accumulated at regulatory element boundaries in open chromatin, where accumulation of particular retrotransposon types depended on insertion size and local regulatory element density. From our results, we propose a model where density and distribution of genes and regulatory elements canalise the accumulation of retrotransposons. Through conservation of synteny, gene regulation and nuclear organisation, we have found that mammalian genomes follow similar evolutionary trajectories.

Abstract The forces driving the accumulation and removal of non-coding DNA and ultimately the evolution of genome size in complex organisms are intimately linked to genome structure and organisation. Our analysis provides a novel method for capturing the regional variation of lineage-specific DNA gain and loss events in their respective genomic contexts. To further understand this connection we used comparative genomics to identify genome-wide individual DNA gain and loss events in the human and mouse genomes. Focusing on the distribution of DNA gains and losses, relationships to important structural features and potential impact on biological processes, we found that in autosomes, DNA gains and losses both followed separate lineage-specific accumulation patterns. However, in both species chromosome X was particularly enriched for DNA gain, consistent with its high L1 retrotransposon content required for X inactivation. We found that DNA loss was associated with gene-rich open chromatin regions and DNA gain events with gene-poor closed chromatin regions. Additionally, we found that DNA loss events tended to be smaller than DNA gain events suggesting that they were more tolerated in open chromatin regions. GO term enrichment in human gain hotspots showed terms related to cell cycle/metabolism, human loss hotspots were enriched for terms related to gene silencing, and mouse gain hotspots were enriched for terms related to transcription regulation. Interestingly, mouse loss hotspots were strongly enriched for terms related to developmental processes, suggesting that DNA loss in mouse is associated with phenotypic changes in mouse morphology. This is consistent with a model in which DNA gain and loss results in turnover or “churning” of regulatory regions that are then subjected to selection, resulting in the differences we now observe, both genomic and phenotypic/morphological.

Background: Transposable elements (TEs) are primarily responsible for the changes in genome sequences that occur over time within and between species. TEs themselves evolve, with clade specific LTR/ERV, LINEs and SINEs responsible for the bulk of species specific genomic features. Because TEs can contain regulatory motifs, they can be exapted as regulators of gene expression. While TE insertions can provide evolutionary novelty for the regulation of gene expression, their overall impact on the evolution of gene expression is unclear. Previous investigators have shown that tissue specific gene expression in amniotes is more similar across species than within species, supporting the existence of conserved developmental gene regulation. In order to understand how species specific TE insertions might affect the evolution/conservation of gene expression, we have looked at the association of gene expression in six tissues with TE insertions in six representative amniote genomes (human, opossum, platypus, anole lizard, bearded dragon and chicken). Results: We have used a novel bootstrapping approach to minimise the conflation of effects of repeat types on gene expression. We compared the expression of orthologs containing different types of recent TE insertions to orthologs that contained older TE insertions and found significant differences in gene expression associated with TE insertions. Likewise, we compared the expression of non-ortholog genes containing different types of recent TE insertions to non-orthologs with older TE insertions and found significant differences in gene expression associated with TE insertions. As expected TEs were associated with species-specific changes in gene expression, but the magnitude and direction of change of expression changes were unexpected. Overall, orthologs containing clade specific TEs were associated with lower gene expression, while in non-orthologs, non clade-specific TEs were associated with higher gene expression. Exceptions were SINE elements in human and chicken, which had an opposite association with gene expression compared to other species. Conclusions: Our observed species-specific associations of TEs with gene expression support a role for TEs in speciation/response to selection by species. TEs do not exhibit consistent associations with gene expression and observed associations can vary depending on the age of TE insertions. Based on these observations, it would be prudent to refrain from extrapolating these and previously reported associations to distantly related species.

Drug-drug interactions (DDIs), especially with herbal medicines, are complex, making it difficult to identify potential molecular mechanisms and targets. We introduce a workflow to carry out DDI research using transcriptome analysis and interactions of a complex herbal mixture, Compound Kushen Injection (CKI), with cancer chemotherapy drugs, as a proof of principle. Using CKI combined with doxorubicin or 5-Fu on cancer cells as a model, we found that CKI enhanced the cytotoxic effects of doxorubicin on A431 cells while protecting MDA-MB-231 cells treated with 5-Fu. We generated and analysed transcriptome data from cells treated with single treatments or combined treatments and our analysis showed that opposite directions of regulation for pathways related to DNA synthesis and metabolism appeared to be the main reason for different effects of CKI when used in combination with chemotherapy drugs . We also found that pathways related to organic biosynthetic and metabolic processes might be potential targets for CKI when interacting with doxorubicin and 5-Fu. Through co-expression analysis correlated with phenotype results, we selected the MYD88 gene as a candidate major regulator for validation as a proof of concept for our approach. Inhibition of MYD88 reduced antagonistic cytotoxic effects between CKI and 5-Fu, indicating that MYD88 is an important gene in the DDI mechanism between CKI and chemotherapy drugs. These findings demonstrate that our pipeline is effective for the application of transcriptome analysis to the study of DDIs in order to identify candidate mechanisms and potential targets.

bíogo is a framework designed to ease development and maintenance of computationally intensive bioinformatics applications. The library is written in the Go programming language, a garbage-collected, strictly typed compiled language with built in support for concurrent processing, and performance comparable to C and Java. It provides a variety of data types and utility functions to facilitate manipulation and analysis of large scale genomic and other biological data. bíogo uses a concise and expressive syntax, lowering the barriers to entry for researchers needing to process large data sets with custom analyses while retaining computational safety and ease of code review. We believe bíogo provides an excellent environment for training and research in computational biology because of its combination of strict typing, simple and expressive syntax, and high performance.