Summary

 Stroma is a poorly defined non-parenchymal component of virtually every organ with key roles in organ development, homeostasis, and repair. Studies of the bone marrow stroma have defined individual populations in the stem cell niche regulating hematopoietic regeneration and capable of initiating leukemia. Here, we use single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to define a cellular taxonomy of the mouse bone marrow stroma and its perturbation by malignancy. We identified seventeen stromal subsets expressing distinct hematopoietic regulatory genes spanning new fibroblastic and osteoblastic subpopulations including distinct osteoblast differentiation trajectories. Emerging acute myeloid leukemia impaired mesenchymal osteogenic differentiation and reduced regulatory molecules necessary for normal hematopoiesis. These data suggest that tissue stroma responds to malignant cells by disadvantaging normal parenchymal cells. Our taxonomy of the stromal compartment provides a comprehensive bone marrow cell census and experimental support for cancer cell crosstalk with specific stromal elements to impair normal tissue function and thereby enable emergent cancer.

Abstract Bone metastases are devastating complications of cancer. They are particularly common in prostate cancer, represent incurable disease and are refractory to immunotherapy. We sought to define distinct features of the bone marrow microenvironment by analyzing single cells from prostate cancer patients’ involved bone, uninvolved bone and distant bone sites as well as bone from cancer-free, orthopedic patients and healthy individuals. Metastatic prostate cancer was associated with multifaceted immune distortion, specifically exhaustion of distinct T cell subsets, appearance of macrophages with states specific to prostate cancer bone metastases. The chemokine CCL20 was notably overexpressed by myeloid cells, as was its cognate CCR6 receptor on T cells. Disruption of the CCL20-CCR6 axis in mice with syngeneic prostate bone metastases restored T cell reactivity and significantly prolonged animal survival. Comparative high resolution analysis of prostate cancer bone metastasis shows a targeted approach for relieving local immunosuppression for therapeutic effect.

Abstract Thymic atrophy and the progressive immune decline that accompanies it is a major health problem, chronically with age and acutely with immune injury. No solution has been defined. Here we demonstrate that one of the three mesenchymal cell subsets identified by single-cell analysis of human and mouse thymic stroma is a critical niche component for T lymphopoiesis. The Postn+ subset is located perivascularly in the cortical-medullary junction, medulla and subcapsular regions. Cell depletion demonstrated that it recruits T competent cells to the thymus and initiates T lymphopoiesis in vivo . This subset distinctively expresses the chemokine Ccl19 necessary for niche functions. It markedly declines with age and in the acute setting of hematopoietic stem cell transplant conditioning. When isolated and adoptively transferred, these cells durably engrafted the atrophic thymus, recruited early T progenitors, increased T cell neogenesis, expanded TCR complexity and enhanced T cell response to vaccination. These data define a thymus lymphopoietic niche cell type that may be manipulated therapeutically to regenerate T lymphopoiesis.

Single-cell RNA-seq protocols provide powerful means for examining the gamut of cell types and transcriptional states that comprise complex biological tissues. Recently-developed approaches based on droplet microfluidics, such as inDrop or Drop-seq, use massively multiplexed barcoding to enable simultaneous measurements of transcriptomes for thousands of individual cells. The increasing complexity of such data also creates challenges for subsequent computational processing and troubleshooting of these experiments, with few software options currently available. Here we describe a flexible pipeline for processing droplet-based transcriptome data that implements barcode corrections, classification of cell quality, and diagnostic information about the droplet libraries. We introduce advanced methods for correcting composition bias and sequencing errors affecting cellular and molecular barcodes to provide more accurate estimates of molecular counts in individual cells.

Stroma is a poorly defined non-parenchymal component of virtually every organ with key roles in organ development, homeostasis and repair. Studies of the bone marrow stroma have defined individual populations in the stem cell niche regulating hematopoietic regeneration and capable of initiating leukemia. Here, we use single-cell RNA-seq to define a cellular taxonomy of the mouse bone marrow stroma and its perturbation by malignancy. We identified seventeen stromal subsets expressing distinct hematopoietic regulatory genes, spanning new fibroblastic, and osteoblastic subpopulations. Emerging acute myeloid leukemia resulted in impaired osteogenic differentiation and reduced production of hematopoietic regulatory molecules necessary for normal hematopoiesis. Thus, cancer can affect tissue stroma in which they reside to disadvantage normal parenchymal cells. Our taxonomy of the regulatory stromal compartment provides experimental support for a model where malignant clone is not a destroyer of normal tissue but an architect of it, remodeling tissue stroma to enable emergent cancer.

Abstract Extracellular vesicles transfer complex biologic material between cells, whose role in in-vivo organismal physiology is poorly defined. Here, we demonstrate that osteoblastic cells in the bone marrow elaborate extracellular vesicles that are taken up by hematopoietic progenitor cells in vivo . Genotoxic or infectious stress rapidly increased stromal-derived extracellular vesicle transfer to granulocyte-monocyte progenitors. Stimulating osteoblastic cells with parathyroid hormone or activating its receptor enhanced extracellular vesicle transfer, myeloid recovery post radiation and improved animal survival from Candida sepsis. The extracellular vesicles contained tiRNAs known to modulate protein translation. 5’-ti-Pro-CGG-1 was preferentially abundant in osteoblast-derived extracellular vesicles and when transferred to granulocyte macrophage progenitors, increased protein translation, cell proliferation and myeloid differentiation. Therefore, EV-mediated tiRNA transfer provides a stress modulated signaling axis distinct from conventional cytokine-driven stress responses. One sentence summary Stress regulated tiRNA transfer alters hematopoiesis