Tandem repeats (TRs) are highly prone to variation in copy numbers due to their repetitive and unstable nature, which makes them a major source of genomic variation between individuals. However, population variation of TRs have not been widely explored due to the limitations of existing tools, which are either low-throughput or restricted to a small subset of TRs. Here, we used SureSelect targeted sequencing approach combined with Nanopore sequencing to overcome these limitations. We achieved an average of 3062-fold target enrichment on a panel of 142 TR loci, generating an average of 97X sequence coverage on 7 samples utilizing 2 MinION flow-cells with 200ng of input DNA per sample. We identified a subset of 110 TR loci with length less than 2kb, and GC content greater than 25% for which we achieved an average genotyping rate of 75% and increasing to 91% for the highest-coverage sample. Alleles estimated from targeted long-read sequencing were concordant with gold standard PCR sizing analysis and moreover highly correlated with alleles estimated from whole genome long-read sequencing. We demonstrate a targeted long-read sequencing approach that enables simultaneous analysis of hundreds of TRs and accuracy is comparable to PCR sizing analysis. Our approach is feasible to scale for more targets and more samples facilitating large-scale analysis of TRs.

A better understanding of the genomic changes that facilitate the emergence and spread of drug resistant M. tuberculosis strains is required. We sequenced an extensively drug resistant (XDR) Beijing sub-lineage 2.2.1.1 strain from the Western Province of Papua New Guinea using long-read sequencing (Oxford Nanopore MinION). We assembled a 4404947bp circular genome with 3670 coding sequences including highly repetitive PE/PPE genes. Comparison with Illumina reads indicated a base-level accuracy of 99.95%. Mutations known to confer drug resistance to first and second line drugs were identified and concurred with phenotypic resistance assays. We identified mutations in efflux pump genes (Rv0194), transporters (secA1, glnQ, uspA), cell wall biosynthesis genes (pdk, mmpL, fadD) and virulence genes (mce-gene family, mycp1) that may contribute to the drug resistance phenotype and successful transmission of this strain. Using the newly assembled genome as reference to map raw Illumina reads from representative M. tuberculosis lineages, we detect large insertions relative to the reference genome. We provide a fully annotated genome of a transmissible XDR M. tuberculosis strain from Papua New Guinea using Oxford Nanopore MinION sequencing and provide insight into genomic mechanisms of resistance and virulence.

Motivation: The recently introduced barcoding protocol to Oxford Nanopore sequencing has increased the versatility of the technology. Several bioinformatic tools have been developed to demultiplex the barcoded reads, but none of them support the streaming analysis. This limits the use of pooled sequencing in real-time applications, which is one of the main advantages of the technology. Results: We introduced npBarcode, an open source and cross platform tool for barcode demultiplex in streaming fashion. npBarcode can be seamlessly integrated into a streaming analysis pipeline. The tool also provides a friendly graphical user interface through npReader, allowing the real-time visual monitoring of the sequencing progress of barcoded samples. We show that npBarcode achieves comparable accuracies to the other alternatives. Availability: npBarcode is bundled in Japsa - a Java tools kit for genome analysis, and is freely available at https://github.com/hsnguyen/npBarcode

Background: Tandem repeats comprise significant proportion of the human genome including coding and regulatory regions. They are highly prone to repeat number variation and nucleotide mutation due to their repetitive and unstable nature, making them a major source of genomic variation between individuals. Despite recent advances in high throughput sequencing, analysis of tandem repeats in the context of complex diseases is still hindered by technical limitations. Methods: We report a novel targeted sequencing approach, which allows simultaneous analysis of hundreds of repeats. We developed a Bayesian algorithm, namely - GtTR - which combines information from a reference long-read dataset with a short read counting approach to genotype tandem repeats at population scale. PCR sizing analysis was used for validation. Results: We used a PacBio long-read sequenced sample to generate a reference tandem repeat genotype dataset with on average 13% absolute deviation from PCR sizing results. Using this reference dataset GtTR generated estimates of VNTR copy number with accuracy within 95% high posterior density (HPD) intervals of 68% and 83% for capture sequence data and 200X WGS data respectively, improving to 87% and 94% with use of a PCR reference. We show that the genotype resolution increases as a function of depth, such that the median 95% HPD interval lies within 25%, 14%, 12% and 8% of the its midpoint copy number value for 30X, 200X WGS, 395X and 800X capture sequence data respectively. We validated nine targets by PCR sizing analysis and genotype estimates from sequencing results correlated well with PCR results. Conclusions: The novel genotyping approach described here presents a new cost-effective method to explore previously unrecognized class of repeat variation in GWAS studies of complex diseases at the population level. Further improvements in accuracy can be obtained by improving accuracy of the reference dataset.

ABSTRACT Klebsiella pneumoniae frequently harbour multidrug resistance and current methodologies are struggling to rapidly discern feasible antibiotics to treat these infections. While rapid DNA sequencing has been proposed for prediction of resistance profile; the role of rapid RNA sequencing has yet to be fully explored. The MinION sequencer can sequence native DNA and RNA in real-time, providing an opportunity to contrast the utility of DNA and RNA for prediction of drug susceptibility. This study interrogated the genome and transcriptome of four extensively drug-resistant (XDR) K. pneumoniae clinical isolates. The majority of acquired resistance (≥75%) resided on plasmids including several megaplasmids (≥100 kbp). DNA sequencing identified most resistance genes (≥70%) within 2 hours of sequencing. Direct RNA sequencing (with a ∼6x slower pore translocation) was able to identify ≥35% of resistance genes, including aminoglycoside, β-lactam, trimethoprim and sulphonamide and also quinolone, rifampicin, fosfomycin and phenicol in some isolates, within 10 hours of sequencing. Polymyxin-resistant isolates showed a heightened transcription of phoPQ ( ≥2-fold) and the pmrHFIJKLM operon (≥8-fold). Expression levels estimated from direct RNA sequencing displayed strong correlation (Pearson: 0.86) compared to qRT-PCR across 11 resistance genes. Overall, MinION sequencing rapidly detected the XDR K. pneumoniae resistome and direct RNA sequencing revealed differential expression of these genes.

Sequencing by translocating DNA fragments through an array of nanopores is a rapidly maturing technology which offers faster and cheaper sequencing than other approaches. However, accurately deciphering the DNA sequence from the noisy and complex electrical signal is challenging. Here, we report Chiron, the first deep learning model to achieve end-to-end basecalling: directly translating the raw signal to DNA sequence without the error-prone segmentation step. Trained with only a small set of 4000 reads, we show that our model provides state-of-the-art basecalling accuracy even on previously unseen species. Chiron achieves basecalling speeds of over 2000 bases per second using desktop computer graphics processing units.

Detection of genomic inversions remains challenging. Many existing methods primarily target inversions with a non repetitive breakpoint, leaving inverted repeat (IR) mediated non-allelic homologous recombination (NAHR) inversions largely unexplored. We present npInv, a novel tool specifically for detecting and genotyping NAHR inversion using long read sub-alignment of long read sequencing data. We use npInv to generate a whole-genome inversion map for NA12878 consisting of 30 NAHR inversions (of which 15 are novel), including all previously known NAHR mediated inversions in NA12878 with flanking IR less than 7kb. Our genotyping accuracy on this dataset was 94%. We used PCR to confirm presence of two of these novel NAHR inversions. We show that there is a near linear relationship between the length of flanking IR and the size of the NAHR inversion.