ABSTRACT Type IV pili (T4P) are dynamic surface appendages that promote virulence, biofilm formation, horizontal gene transfer, and motility in diverse bacterial species. Pilus dynamic activity is best characterized in T4P that use distinct ATPase motors for pilus extension and retraction. Many T4P systems, however, lack a dedicated retraction motor and the mechanism underlying this motor-independent retraction remains a mystery. Using the Vibrio cholerae competence pilus as a model system, we identify mutations in the major pilin gene that enhance motor-independent retraction. These mutants produced less stable pili, likely due to diminished pilin-pilin interactions within the filament. One mutation adds a bulky residue to α1C, a universally conserved feature of type IV pilins. We found that inserting a bulky residue into α1C of the retraction motor-dependent Acinetobacter baylyi com-petence T4P is sufficient to induce motor-independent retraction. Conversely, removing bulky residues from α1C of the retraction motor-independent V. cholerae toxin-co-regulated T4P stabilizes the filament and prevents retraction. Furthermore, alignment of pilins from the broader type IV filament (T4F) family indicated that retraction motor-independent T4P, Com pili, and type II secretion systems generally encode larger residues within α1C oriented toward the pilus core compared to retraction motor-dependent T4P. Together, our data demonstrate that motor-independent retraction relies on the inherent instability of the pilus filament that may be conserved in diverse T4Fs. This provides the first evidence for a long-standing, yet untested, model in which pili retract in the absence of a motor by spontaneous de-polymerization. SIGNIFICANCE Extracellular pilus filaments are critical for the virulence and persistence of many bacterial pathogens. A crucial property of these filaments is their ability to dynamically extend and retract from the bacterial surface. A detailed mechanistic understanding of pilus retraction, however, remains lacking in many systems. Here, we reveal that pilus retraction is an inherent property of the pilus filament. These observations are broadly relevant to diverse pilus systems, including those in many bacterial pathogens, and may help inform novel therapeutic strategies that aim to target pilus dynamic activity.

SUMMARY The competence pili of transformable Gram-positive species form a subset of the diverse and widespread class of extracellular filamentous organelles known as type IV pili (T4P). In Gram-negative bacteria, T4P act through dynamic cycles of extension and retraction to carry out diverse activities including attachment, motility, protein secretion, and DNA uptake. It remains unclear whether T4P in Gram-positive species exhibit this same dynamic activity, and their mechanism of action for DNA uptake remains unclear. They are hypothesized to either (1) passively form transient cavities in the cell wall to facilitate DNA passage, (2) act as static adhesins to enrich DNA near the cell surface for subsequent uptake by membrane-embedded transporters, or (3) play an active role in translocating bound DNA via their dynamic activity. Here, using a recently described pilus labeling approach, we demonstrate that pneumococcal competence pili are highly dynamic structures that rapidly extend and retract from the cell surface. By labeling ComGC with bulky adducts, we further demonstrate that pilus retraction is essential for natural transformation. Together, our results indicate that Gram-positive type IV competence pili are dynamic and retractile structures that play an active role in DNA uptake. Short summary Competent pneumococci kill non-competent cells on contact. Retractable DNA-binding fibers in the class of type IV pili may provide a key tool for retrieving DNA segments from cell wreckage for internalization and recombination.

Abstract Surface association provides numerous fitness advantages to bacteria. Thus, it is critical for bacteria to recognize surface contact and to consequently initiate physiological changes required for a surface-associated lifestyle ( 1 ). Ubiquitous microbial appendages called pili are involved in sensing surfaces and mediating downstream surface-associated behaviors ( 2 – 6 ). The mechanism by which pili mediate surface sensing remains unknown, largely due to the difficulty to visualize their dynamic nature and to directly modulate their activity without genetic modification. Here, we show that Caulobacter crescentus pili undergo dynamic cycles of extension and retraction that cease within seconds of surface contact, and this arrest of pilus activity coincides with surface-stimulated holdfast synthesis. By physically blocking pili, we show that imposing resistance to pilus retraction is sufficient to stimulate holdfast synthesis in the absence of surface contact. Thus, resistance to type IV pilus retraction upon surface attachment is used for surface sensing. One Sentence Summary Bacteria use the tension imparted on retracting pilus fibers upon their binding to a surface for surface sensing.

ABSTRACT Bacteria utilize dynamic appendages called type IV pili (T4P) to interact with their environment and mediate a wide variety of functions. Pilus extension is mediated by an extension ATPase motor, commonly called PilB, in all T4P. Pilus retraction, however, can either occur with the aid of an ATPase motor, or in the absence of a retraction motor. While much effort has been devoted to studying motor-dependent retraction, the mechanism and regulation of motor-independent retraction remains poorly characterized. We have previously demonstrated that Vibrio cholerae competence T4P undergo motor-independent retraction in the absence of the dedicated retraction ATPases PilT and PilU. Here, we utilize this model system to characterize the factors that influence motor-independent retraction. We find that freshly extended pili frequently undergo motor-independent retraction, but if these pili fail to retract immediately, they remain statically extended on the cell surface. Importantly, we show that these static pili can still undergo motor-dependent retraction via tightly regulated ectopic expression of PilT, suggesting that these T4P are not broken, but simply cannot undergo motor-independent retraction. Through additional genetic and biophysical characterization of pili, we suggest that pilus filaments undergo conformational changes during dynamic extension and retraction. We propose that only some conformations, like those adopted by freshly extended pili, are capable of undergoing motor-independent retraction. Together, these data highlight the versatile mechanisms that regulate T4P dynamic activity and provide additional support for the long-standing hypothesis that motor-independent retraction occurs via spontaneous depolymerization. SIGNIFICANCE Extracellular pilus fibers are critical to the virulence and persistence of many pathogenic bacteria. A crucial function for most pili is the dynamic ability to extend and retract from the cell surface. Inhibiting this dynamic pilus activity represents an attractive approach for therapeutic interventions, however, a detailed mechanistic understanding of this process is currently lacking. Here, we use the competence pilus of Vibrio cholerae to study how pili retract in the absence of dedicated retraction motors. Our results reveal a novel regulatory mechanism of pilus retraction that is an inherent property of the external pilus filament. Thus, understanding the conformational changes that pili adopt under different conditions may be critical for the development of novel therapeutics that aim to target the dynamic activity of these structures.

Abstract The marine facultative pathogen Vibrio cholerae forms complex multicellular communities on the chitinous shells of crustacean zooplankton in its aquatic reservoir. V. cholerae -chitin interactions are critical for the growth, evolution, and waterborne transmission of cholera. This is due, in part, to chitin-induced changes in gene expression in this pathogen. Here, we sought to identify factors that influence chitin-induced expression of one locus, the chitobiose utilization operon ( chb ), which is required for the uptake and catabolism of the chitin disaccharide. Through a series of genetic screens, we identified that the master regulator of quorum sensing, HapR, is a direct repressor of the chb operon. We also found that the levels of HapR in V. cholerae are regulated by the ClpAP protease. Furthermore, we show that the canonical quorum sensing cascade in V. cholerae regulates chb expression in a HapR-dependent manner. Through this analysis we found that signaling via the species-specific autoinducer CAI-1, but not the inter-species autoinducer AI-2, influences chb expression. This phenomenon of species-specific regulation may enhance the fitness of this pathogen in its environmental niche. Importance In nature, bacteria live in multicellular and multispecies communities. Microbial species can sense the density and composition of their community through chemical cues using a process called quorum sensing (QS). The marine pathogen Vibrio cholerae is found in communities on the chitinous shells of crustaceans in its aquatic reservoir. V. cholerae interactions with chitin are critical for the survival, evolution, and waterborne transmission of this pathogen. Here, we show that V. cholerae uses QS to regulate the expression of one locus required for V. cholerae -chitin interactions.

Abstract Bacteria use extracellular appendages called type IV pili (T4P) for diverse behaviors including DNA uptake, surface sensing, virulence, protein secretion, and twitching motility 1 . Dynamic extension and retraction of T4P is essential for their function, yet little is known about the mechanisms controlling these dynamics or the extent to which their regulation is conserved across bacterial species. Here, we develop Acinetobacter baylyi as a new model to study T4P by employing a recently developed pilus labeling method 2,3 . Our findings overturn the current dogma that T4P extension occurs through the action of a single, highly conserved motor, PilB, by showing that T4P synthesis in A. baylyi is dependent on an additional, phylogenetically distinct motor, TfpB. Furthermore, we uncover an inhibitor of T4P extension that specifically binds to and inhibits PilB but not TfpB. These results expand our understanding of T4P regulation and highlight how inhibitors might be exploited to inhibit T4P synthesis.

Abstract Bacterial type IV pili are critical for diverse biological processes including horizontal gene transfer, surface sensing, biofilm formation, adherence, motility, and virulence. These dynamic appendages extend and retract from the cell surface. In many type IVa pilus systems, extension occurs through the action of an extension ATPase, often called PilB, while optimal retraction requires the action of a retraction ATPase, PilT. Many type IVa systems also encode a homolog of PilT called PilU. However, the function of this protein has remained unclear because pilU mutants exhibit inconsistent phenotypes among type IV pilus systems and because it is relatively understudied compared to PilT. Here, we study the type IVa competence pilus of Vibrio cholerae as a model system to define the role of PilU. We show that the ATPase activity of PilU is critical for pilus retraction in PilT Walker A and/or Walker B mutants. PilU does not, however, contribute to pilus retraction in Δ pilT strains. Thus, these data suggest that PilU is a bona fide retraction ATPase that supports pilus retraction in a PilT-dependent manner. We also found that a Δ pilU mutant exhibited a reduction in the force of retraction suggesting that PilU is important for generating maximal retraction forces. Additional in vitro and in vivo data show that PilT and PilU act as independent homo-hexamers that may form a complex to facilitate pilus retraction. Finally, we demonstrate that the role of PilU as a PilT-dependent retraction ATPase is conserved in Acinetobacter baylyi , suggesting that the role of PilU described here may be broadly applicable to other type IVa pilus systems. Author Summary Almost all bacterial species use thin surface appendages called pili to interact with their environments. These structures are critical for the virulence of many pathogens and represent one major way that bacteria share DNA with one another, which contributes to the spread of antibiotic resistance. To carry out their function, pili dynamically extend and retract from the bacterial surface. Here, we show that retraction of pili in some systems is determined by the combined activity of two motor ATPase proteins.

Chitin utilization by the cholera pathogen Vibrio cholerae is required for its persistence and evolution via horizontal gene transfer in the marine environment. Genes involved in the uptake and catabolism of the chitin disaccharide chitobiose are encoded by the chb operon. The orphan sensor kinase ChiS is critical for regulation of this locus, however, the mechanisms downstream of ChiS activation that result in expression of the chb operon are poorly understood. Using an unbiased transposon mutant screen, we uncover that the nucleoid occlusion protein SlmA is a regulator of the chb operon. SlmA has not previously been implicated in gene regulation. Also, SlmA is a member of the TetR family of proteins, which are generally transcriptional repressors. In vitro, we find that SlmA binds directly to the chb operon promoter, and in vivo, we show that this interaction is, surprisingly, required for transcriptional activation of this locus and for chitobiose utilization. Using point mutations that disrupt distinct functions of SlmA, we find that DNA-binding, but not nucleoid occlusion, is critical for transcriptional activation. This study identifies a novel role for SlmA as a transcriptional regulator in V. cholerae in addition to its established role as a cell division licensing factor.

In marine Vibrio species, chitin-induced natural transformation enables bacteria to take up DNA from the external environment and integrate it into their genome via homologous recombination. Expression of the master competence regulator TfoX bypasses the need for chitin induction and drives expression of the genes required for competence in several Vibrio species. Here, we show that TfoX expression in two Vibrio campbellii strains, DS40M4 and NBRC 15631, enables high frequencies of natural transformation. Conversely, transformation was not achieved in the model quorum-sensing strain V. campbellii BB120 (previously classified as Vibrio harveyi). Surprisingly, we find that quorum sensing is not required for transformation in V. campbellii DS40M4. This result is in contrast to Vibrio cholerae that requires the quorum-sensing regulator HapR to activate the competence regulator QstR. However, similar to V. cholerae, QstR is necessary for transformation in DS40M4. To investigate the difference in transformation frequencies between BB120 and DS40M4, we used previously studied V. cholerae competence genes to inform a comparative genomics analysis coupled with transcriptomics. BB120 encodes homologs of all known competence genes, but most of these genes were not induced by ectopic expression of TfoX, which likely accounts for the non-functional natural transformation in this strain. Comparison of transformation frequencies among Vibrio species indicates a wide disparity among even closely related strains, with Vibrio vulnificus having the lowest functional transformation frequency. We show that ectopic expression of both TfoX and QstR is sufficient to produce a significant increase in transformation frequency in Vibrio vulnificus.

Natural transformation (NT) is a major mechanism of horizontal gene transfer in microbial species that promotes the spread of antibiotic resistance determinants and virulence factors. Here, we develop a cell biological approach to characterize the spatial and temporal dynamics of homologous recombination during NT in Vibrio cholerae. Our results directly demonstrate (1) that transforming DNA efficiently integrates into the genome as single-stranded DNA, (2) that the resulting heteroduplexes are resolved by chromosome replication and segregation, and (3) that integrated DNA is rapidly expressed prior to cell division. We show that the combination of these properties results in the epigenetic transfer of gene products within transformed populations, which can support the transgenerational epigenetic inheritance of antibiotic resistance in both V. cholerae and Streptococcus pneumoniae. Thus, beyond the genetic acquisition of novel DNA sequences, NT can also promote the epigenetic inheritance of traits during this conserved mechanism of horizontal gene transfer.