Tat is an 86-amino acid protein involved in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Several studies have shown that exogenous Tat protein was able to translocate through the plasma membrane and to reach the nucleus to transactivate the viral genome. A region of the Tat protein centered on a cluster of basic amino acids has been assigned to this translocation activity. Recent data have demonstrated that chemical coupling of a Tat-derived peptide (extending from residues 37 to 72) to several proteins allowed their functional internalization into several cell lines or tissues. A part of this same domain can be folded in an α-helix structure with amphipathic characteristics. Such helical structures have been considered as key determinants for the uptake of several enveloped viruses by fusion or endocytosis. In the present study, we have delineated the main determinants required for Tat translocation within this sequence by synthesizing several peptides covering the Tat domain from residues 37 to 60. Unexpectedly, the domain extending from amino acid 37 to 47, which corresponds to the α-helix structure, is not required for cellular uptake and for nuclear translocation. Peptide internalization was assessed by direct labeling with fluorescein or by indirect immunofluorescence using a monoclonal antibody directed against the Tat basic cluster. Both approaches established that all peptides containing the basic domain are taken up by cells within less than 5 min at concentrations as low as 100 nm. In contrast, a peptide with a full α-helix but with a truncated basic amino acid cluster is not taken up by cells. The internalization process does not involve an endocytic pathway, as no inhibition of the uptake was observed at 4 °C. Similar observations have been reported for a basic amino acid-rich peptide derived from the Antennapedia homeodomain (1). Short peptides allowing efficient translocation through the plasma membrane could be useful vectors for the intracellular delivery of various non-permeant drugs including antisense oligonucleotides and peptides of pharmacological interest. Tat is an 86-amino acid protein involved in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Several studies have shown that exogenous Tat protein was able to translocate through the plasma membrane and to reach the nucleus to transactivate the viral genome. A region of the Tat protein centered on a cluster of basic amino acids has been assigned to this translocation activity. Recent data have demonstrated that chemical coupling of a Tat-derived peptide (extending from residues 37 to 72) to several proteins allowed their functional internalization into several cell lines or tissues. A part of this same domain can be folded in an α-helix structure with amphipathic characteristics. Such helical structures have been considered as key determinants for the uptake of several enveloped viruses by fusion or endocytosis. In the present study, we have delineated the main determinants required for Tat translocation within this sequence by synthesizing several peptides covering the Tat domain from residues 37 to 60. Unexpectedly, the domain extending from amino acid 37 to 47, which corresponds to the α-helix structure, is not required for cellular uptake and for nuclear translocation. Peptide internalization was assessed by direct labeling with fluorescein or by indirect immunofluorescence using a monoclonal antibody directed against the Tat basic cluster. Both approaches established that all peptides containing the basic domain are taken up by cells within less than 5 min at concentrations as low as 100 nm. In contrast, a peptide with a full α-helix but with a truncated basic amino acid cluster is not taken up by cells. The internalization process does not involve an endocytic pathway, as no inhibition of the uptake was observed at 4 °C. Similar observations have been reported for a basic amino acid-rich peptide derived from the Antennapedia homeodomain (1). Short peptides allowing efficient translocation through the plasma membrane could be useful vectors for the intracellular delivery of various non-permeant drugs including antisense oligonucleotides and peptides of pharmacological interest. Most "information-rich" molecules, such as oligonucleotides, genes, peptides, or proteins, are poorly taken up by cells since they do not efficiently cross the lipid bilayer of the plasma membrane or of the endocytic vesicles (Ref. 2Lebleu B. Trends Biotechnol. 1996; 14: 109-110Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar, and references therein). This is considered to be a major limitation for their ex vivo orin vivo use in fundamental studies or in possible clinical applications. These compounds are currently delivered by various techniques including microinjection, electroporation, association with cationic lipids, liposome encapsidation, or receptor-mediated endocytosis. Various problems have been encountered in their use including low transfer efficiency, complex manipulation, cellular toxicity, or immunogenicity, which would preclude their routine usein vivo. As an alternative, several peptides have been successfully used to improve the intracellular delivery of nucleic acids or proteins. The fusogenic properties of influenza virus have been extensively studied in this context. They are currently assigned to a pH-dependent conformational change of the viral hemagglutinin leading to the exposure of its hydrophobic N-terminal region, and to the fusion of the viral and endosomal membranes (3Plank C. Oberhauser B. Mechtler K. Koch C. Wagner E. J. Biol. Chem. 1994; 269: 12918-12924Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). A Tat mRNA-specific antisense oligonucleotide covalently bound to this fusogenic peptide has been demonstrated to have an increased antiviral activity in vitro, probably as a result of increased cellular uptake (4Bongartz J.P. Aubertin A.-M. Milhaud P.G. Lebleu B. Nucleic Acids Res. 1994; 22: 4681-4688Crossref PubMed Scopus (146) Google Scholar). Peptides adopting an amphipathic conformation at acidic pH largely increased the delivery of plasmid DNA complexed with transferrin-polylysine conjugates (5Wagner E. Plank C. Zatloukal K. Cotten M. Birnstiel M.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 7934-7938Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar). Likewise, amphipathic characteristics have been described for a peptide derived from the third domain of Antennapedia homeodomain (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), which allows the delivery of antisense oligonucleotides or biologically active peptides. Interestingly, this peptide was efficiently translocated through the plasma membrane in the absence of energy (e.g. via a mechanism that does not involve endocytosis). The HIV 1The abbreviations used are: HIV, human immunodeficiency virus; NLS, nuclear localization signal; Boc,t-butyloxycarbonyl; HF, hydrogen fluoride; HPLC, high performance liquid chromatography; PBS, phosphate-buffered saline; FCS, fetal calf serum; NEM, N-ethylmaleimide; FACS, fluorescence-activated cell sorting; TAMRA-SE, tetramethylrhodamine succinimidyl ester; MTT, [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide. 1The abbreviations used are: HIV, human immunodeficiency virus; NLS, nuclear localization signal; Boc,t-butyloxycarbonyl; HF, hydrogen fluoride; HPLC, high performance liquid chromatography; PBS, phosphate-buffered saline; FCS, fetal calf serum; NEM, N-ethylmaleimide; FACS, fluorescence-activated cell sorting; TAMRA-SE, tetramethylrhodamine succinimidyl ester; MTT, [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide. Tat transactivation protein is efficiently taken up by cells (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar, 7Mann D.A. Frankel A.D. EMBO J. 1991; 10: 1733-1739Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar, 8Vivès E. Charneau P. Van Rietschoten J. Rochat H. Bahraoui E. J. Virol. 1994; 68: 3343-3353Crossref PubMed Google Scholar), and concentrations as low as 1 nm in the culture media are sufficient to transactivate a reporter gene expressed from the HIV-1 promoter (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar). The domain responsible for this translocation has been ascribed to the region centered on a basic domain of the Tat protein. A peptide extending from residues 37 to 72 allowed the internalization of conjugated proteins such as β-galactosidase or horseradish peroxidase (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). One to two Tat peptides/molecule of protein were sufficient to induce efficient translocation. Likewise, the Tat-(37–62) sequence conjugated to a Fab antibody fragment enhanced its in vitro cell surface association and internalization (10Anderson D.C. Nochols E. Manger R. Woodle D. Barry M. Fritzberg A.R. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993; 194: 876-884Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar). Physicochemical studies involving circular dichroism and energy minimization indicated that the region covering the Tat-(38–49) domain adopted an α-helical structure with amphipathic characteristics (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar). Both biological data and physicochemical studies were in keeping with a crucial role of the α-helix forming domain in Tat uptake. Most of these studies have concerned peptides extending from residues 37 to 72. These include other motifs of interest and in particular a cluster of basic amino acids extending from positions 49 to 58, which does not overlap the presumed amphipathic helical structure. This cluster of basic amino acids (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) appears to be unstructured due to charge repulsions (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar) and contains a nuclear localization signal (NLS) sequence (12Ruben S. Perkins A. Purcell R. Jounc K. Sia R. Burghoff R. Haseltine W.A. Rosen C.A. J. Virol. 1989; 63: 1-8Crossref PubMed Google Scholar).To delineate more precisely which determinants of the Tat-(37–60) peptide are crucial for Tat translocation and nucleolar localization, we have synthesized peptides harboring deletions in the purported α-helix domain or in the basic cluster. These peptides were assayed for their ability to translocate through the cell membrane in several cell lines. Cellular uptake and intracellular distribution were monitored by fluorescence microscopy using peptides labeled with fluorescein maleimide on their C-terminal cysteine or by indirect immunofluorescence using a monoclonal antibody directed against the Tat basic domain. Unexpectedly, the α-helix region did not appear to be required for efficient and fast cell uptake. In contrast, the whole basic domain from the Tat peptide appeared necessary for cell internalization.DISCUSSIONSeveral strategies have been proposed to improve the cellular uptake of proteins or nucleic acids. Some of these are based on the use of peptide sequences from proteins known to translocate through the plasma membrane. Along these lines, the HIV-1 Tat protein is able to cross the plasma membrane and to reach the cell nucleus to transactivate the viral genome (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar, 7Mann D.A. Frankel A.D. EMBO J. 1991; 10: 1733-1739Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar, 8Vivès E. Charneau P. Van Rietschoten J. Rochat H. Bahraoui E. J. Virol. 1994; 68: 3343-3353Crossref PubMed Google Scholar). Moreover, a 35-amino acid peptide from Tat is able to promote the intracellular delivery of covalently bound proteins such as β-galactosidase, RNase A, or horseradish peroxidase in several cell lines and tissues (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). This peptide contains a cluster of basic amino acids extending from residues 49 to 58 and a sequence assumed to adopt an α-helical configuration (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar).The present study aimed at delineating whether shorter domains from this Tat peptide would be sufficient for cell internalization. The main determinant required for translocation was identified as the cluster of basic amino acids while the putative α-helix domain appeared dispensable. The full basic domain is required since a peptide deleted from the three arginine residues at its C-terminal end is not taken up by cells, even at high concentration. In keeping with a requirement for the full complement of positive charges in the Tat basic domain, any deletion or substitution of basic charges within the Tat-(48–60) peptide led to a reduced membrane translocating activity. 2E. Vivès, C. Granier, P. Prévot, and B. Lebleu (1997) Lett. Pept. Sci., in press. Shorter peptides such as Tat-(37–58) or Tat-(47–58) were less efficient carriers of proteins than the original 35-amino acid peptide (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). A steric hindrance between such short peptides and the bound protein could have reduced their availability for translocation.Along the same lines, a 16-amino acid peptide from the Antennapedia third helix homeodomain was described as having a good translocation ability through the plasma membrane, and it was initially assumed that its α-helix structure was important (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Likewise, the fusogenic properties of several viral peptides have been ascribed to α-helical determinants (17Gaudin Y. Ruigrok R.W.H. Brunner J. J. Gen. Virol. 1995; 76: 1541-1556Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). However, it was recently established that the insertion of proline residues, known to disrupt α-helical structures, did not abolish the translocation of the Antennapedia peptide (18Derossi D. Calvet S. Trembleau A. Brunissen A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-18193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). The sequence of this active Antennapedia peptide analogue is Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys. It contains five positive charges (two Arg and three Lys) within a linear sequence of seven residues at its C-terminal end. Similarly, the short Tat basic peptide described here contains eight positive charges within a sequence of nine residues. It is noteworthy that a shorter peptide from Antennapedia deleted of the C-terminal Trp-Lys-Lys residues (i.e. lacking two positive charges) was not internalized (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Although the tryptophan residue was shown to play a role in the translocation event (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), an additional effect of the two Lys residues was not evaluated independently. The data reported with the Antennapedia peptide and those obtained in the present study with the Tat peptide strongly suggest that internalization could be linked to the presence of a high density of positive charges within a short sequence.Both the full-length Antennapedia (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and the Tat-(48–60) peptides (Fig. 1) are taken up efficiently at 4 °C. Likewise, several drugs known to interfere with caveolae-mediated uptake did not affect Tat uptake in our studies. Altogether, these studies strongly suggest that endocytosis is not involved in the uptake of these short basic peptides. On the other hand, the incubation of the Tat peptides with various unbound fluorochromes or with a non-permeant peptide did not induce their uptake. Taken together, these experiments do not support the involvement of a significant membrane disruption by Tat basic peptides or a well defined internalization pathway.The mechanism of translocation of the Tat basic peptide could be analogous to the model proposed for the Antennapedia homeodomain peptide (18Derossi D. Calvet S. Trembleau A. Brunissen A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-18193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). A tight ionic interaction between the basic groups of the peptide side chains and the negative charges of the phospholipid heads could induce a local invagination of the plasma membrane. The local reorganization of the phospholipid bilayer would then lead to the formation of inverted micelles with the peptide enclosed in the hydrophilic cavity and ultimately to the cytoplasmic release of the peptide. Because of the presence of a nuclear localization signal, the Tat peptide is rapidly translocated and concentrates in the nucleus. This would limit its release from the cell by the same mechanism. Further experiments are in progress to assess the reality of this working hypothesis. Additional studies will be required to define more accurately the structural requirements for this translocation activity and to uncover the mechanism by which Tat and possibly other basic peptides cross the plasma membrane.The translocation activity of such small Tat-derived peptides is powerful, as nuclear localization was observed after a few minutes of incubation with the cells. Internalization could be monitored in the micromolar concentration range by indirect immunofluorescence with peptide-specific antibodies or even at an order of magnitude lower by direct labeling of the peptide with a fluorochrome. Previous studies with the Antennapedia peptide made use of incubation times of several hours and routine concentrations of 20 μm (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). These differences were confirmed in a comparative study using the same fluorescein-labeling method for both peptides with Antennapedia peptide kindly provided by G. Chassaing and A. Prochiantz (CNRS URA1414, Ecole Normale Supérieure, Paris, France) (data not shown).The indirect immunodetection of the Tat peptide ensures that its ability to translocate through the plasma membrane was not altered by the reporter group itself. In most published studies, the possible influence of the fluorochrome reporter group or of the biotin-linking arm on the behavior of the peptide was not assessed. Along these lines, the biotinylation of a Tat peptide increased by 6-fold its uptake as compared with the non-biotinylated peptide (19Chen L., L. Frankel A.D. Harder J.L. Fawell S. Barsoum J. Anal. Biochem. 1995; 227: 168-175Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar).The internalization properties of these small Tat basic peptides could then be exploited for the intracellular delivery and for the nuclear targeting of conjugated non-permeant molecules. Ongoing work in our group aims at establishing whether the covalent conjugation through various linking arms of short Tat basic peptides to antisense oligonucleotides, to peptide nucleic acids, or to peptides will lead to their nuclear accumulation. Preliminary data indicate that a peptide which did not enter the cell by itself could be efficiently internalized when conjugated to the shorter Tat peptide.2Along the same lines the covalent linking of a 15-mer oligonucleotides to the 16-amino acid Antennapedia peptide led to improved intracellular delivery and to a significant increase in biological activity (20Allinquant B. Hantraye P. Mailleux P. Moya K. Bouillot C. Prochiantz A. J. Cell Biol. 1995; 128: 919-927Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar).Peptides bearing a high density of basic residues might also improve hybridization properties of antisense oligonucleotides. Previous studies have indeed described the enhanced affinities and kinetics of hybridization for its target sequence of an oligonucleotide covalently linked to a polyarginine sequence (21Wei Z. Tung C.H. Zhu T. Dickerhof W.A. Breslauer K.J. Georgopoulos D.E. Leibowitz M.J. Stein S. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 655-661Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Most "information-rich" molecules, such as oligonucleotides, genes, peptides, or proteins, are poorly taken up by cells since they do not efficiently cross the lipid bilayer of the plasma membrane or of the endocytic vesicles (Ref. 2Lebleu B. Trends Biotechnol. 1996; 14: 109-110Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar, and references therein). This is considered to be a major limitation for their ex vivo orin vivo use in fundamental studies or in possible clinical applications. These compounds are currently delivered by various techniques including microinjection, electroporation, association with cationic lipids, liposome encapsidation, or receptor-mediated endocytosis. Various problems have been encountered in their use including low transfer efficiency, complex manipulation, cellular toxicity, or immunogenicity, which would preclude their routine usein vivo. As an alternative, several peptides have been successfully used to improve the intracellular delivery of nucleic acids or proteins. The fusogenic properties of influenza virus have been extensively studied in this context. They are currently assigned to a pH-dependent conformational change of the viral hemagglutinin leading to the exposure of its hydrophobic N-terminal region, and to the fusion of the viral and endosomal membranes (3Plank C. Oberhauser B. Mechtler K. Koch C. Wagner E. J. Biol. Chem. 1994; 269: 12918-12924Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). A Tat mRNA-specific antisense oligonucleotide covalently bound to this fusogenic peptide has been demonstrated to have an increased antiviral activity in vitro, probably as a result of increased cellular uptake (4Bongartz J.P. Aubertin A.-M. Milhaud P.G. Lebleu B. Nucleic Acids Res. 1994; 22: 4681-4688Crossref PubMed Scopus (146) Google Scholar). Peptides adopting an amphipathic conformation at acidic pH largely increased the delivery of plasmid DNA complexed with transferrin-polylysine conjugates (5Wagner E. Plank C. Zatloukal K. Cotten M. Birnstiel M.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 7934-7938Crossref PubMed Scopus (656) Google Scholar). Likewise, amphipathic characteristics have been described for a peptide derived from the third domain of Antennapedia homeodomain (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), which allows the delivery of antisense oligonucleotides or biologically active peptides. Interestingly, this peptide was efficiently translocated through the plasma membrane in the absence of energy (e.g. via a mechanism that does not involve endocytosis). The HIV 1The abbreviations used are: HIV, human immunodeficiency virus; NLS, nuclear localization signal; Boc,t-butyloxycarbonyl; HF, hydrogen fluoride; HPLC, high performance liquid chromatography; PBS, phosphate-buffered saline; FCS, fetal calf serum; NEM, N-ethylmaleimide; FACS, fluorescence-activated cell sorting; TAMRA-SE, tetramethylrhodamine succinimidyl ester; MTT, [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide. 1The abbreviations used are: HIV, human immunodeficiency virus; NLS, nuclear localization signal; Boc,t-butyloxycarbonyl; HF, hydrogen fluoride; HPLC, high performance liquid chromatography; PBS, phosphate-buffered saline; FCS, fetal calf serum; NEM, N-ethylmaleimide; FACS, fluorescence-activated cell sorting; TAMRA-SE, tetramethylrhodamine succinimidyl ester; MTT, [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide. Tat transactivation protein is efficiently taken up by cells (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar, 7Mann D.A. Frankel A.D. EMBO J. 1991; 10: 1733-1739Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar, 8Vivès E. Charneau P. Van Rietschoten J. Rochat H. Bahraoui E. J. Virol. 1994; 68: 3343-3353Crossref PubMed Google Scholar), and concentrations as low as 1 nm in the culture media are sufficient to transactivate a reporter gene expressed from the HIV-1 promoter (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar). The domain responsible for this translocation has been ascribed to the region centered on a basic domain of the Tat protein. A peptide extending from residues 37 to 72 allowed the internalization of conjugated proteins such as β-galactosidase or horseradish peroxidase (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). One to two Tat peptides/molecule of protein were sufficient to induce efficient translocation. Likewise, the Tat-(37–62) sequence conjugated to a Fab antibody fragment enhanced its in vitro cell surface association and internalization (10Anderson D.C. Nochols E. Manger R. Woodle D. Barry M. Fritzberg A.R. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993; 194: 876-884Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar). Physicochemical studies involving circular dichroism and energy minimization indicated that the region covering the Tat-(38–49) domain adopted an α-helical structure with amphipathic characteristics (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar). Both biological data and physicochemical studies were in keeping with a crucial role of the α-helix forming domain in Tat uptake. Most of these studies have concerned peptides extending from residues 37 to 72. These include other motifs of interest and in particular a cluster of basic amino acids extending from positions 49 to 58, which does not overlap the presumed amphipathic helical structure. This cluster of basic amino acids (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) appears to be unstructured due to charge repulsions (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar) and contains a nuclear localization signal (NLS) sequence (12Ruben S. Perkins A. Purcell R. Jounc K. Sia R. Burghoff R. Haseltine W.A. Rosen C.A. J. Virol. 1989; 63: 1-8Crossref PubMed Google Scholar). To delineate more precisely which determinants of the Tat-(37–60) peptide are crucial for Tat translocation and nucleolar localization, we have synthesized peptides harboring deletions in the purported α-helix domain or in the basic cluster. These peptides were assayed for their ability to translocate through the cell membrane in several cell lines. Cellular uptake and intracellular distribution were monitored by fluorescence microscopy using peptides labeled with fluorescein maleimide on their C-terminal cysteine or by indirect immunofluorescence using a monoclonal antibody directed against the Tat basic domain. Unexpectedly, the α-helix region did not appear to be required for efficient and fast cell uptake. In contrast, the whole basic domain from the Tat peptide appeared necessary for cell internalization. DISCUSSIONSeveral strategies have been proposed to improve the cellular uptake of proteins or nucleic acids. Some of these are based on the use of peptide sequences from proteins known to translocate through the plasma membrane. Along these lines, the HIV-1 Tat protein is able to cross the plasma membrane and to reach the cell nucleus to transactivate the viral genome (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar, 7Mann D.A. Frankel A.D. EMBO J. 1991; 10: 1733-1739Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar, 8Vivès E. Charneau P. Van Rietschoten J. Rochat H. Bahraoui E. J. Virol. 1994; 68: 3343-3353Crossref PubMed Google Scholar). Moreover, a 35-amino acid peptide from Tat is able to promote the intracellular delivery of covalently bound proteins such as β-galactosidase, RNase A, or horseradish peroxidase in several cell lines and tissues (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). This peptide contains a cluster of basic amino acids extending from residues 49 to 58 and a sequence assumed to adopt an α-helical configuration (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar).The present study aimed at delineating whether shorter domains from this Tat peptide would be sufficient for cell internalization. The main determinant required for translocation was identified as the cluster of basic amino acids while the putative α-helix domain appeared dispensable. The full basic domain is required since a peptide deleted from the three arginine residues at its C-terminal end is not taken up by cells, even at high concentration. In keeping with a requirement for the full complement of positive charges in the Tat basic domain, any deletion or substitution of basic charges within the Tat-(48–60) peptide led to a reduced membrane translocating activity. 2E. Vivès, C. Granier, P. Prévot, and B. Lebleu (1997) Lett. Pept. Sci., in press. Shorter peptides such as Tat-(37–58) or Tat-(47–58) were less efficient carriers of proteins than the original 35-amino acid peptide (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). A steric hindrance between such short peptides and the bound protein could have reduced their availability for translocation.Along the same lines, a 16-amino acid peptide from the Antennapedia third helix homeodomain was described as having a good translocation ability through the plasma membrane, and it was initially assumed that its α-helix structure was important (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Likewise, the fusogenic properties of several viral peptides have been ascribed to α-helical determinants (17Gaudin Y. Ruigrok R.W.H. Brunner J. J. Gen. Virol. 1995; 76: 1541-1556Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). However, it was recently established that the insertion of proline residues, known to disrupt α-helical structures, did not abolish the translocation of the Antennapedia peptide (18Derossi D. Calvet S. Trembleau A. Brunissen A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-18193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). The sequence of this active Antennapedia peptide analogue is Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys. It contains five positive charges (two Arg and three Lys) within a linear sequence of seven residues at its C-terminal end. Similarly, the short Tat basic peptide described here contains eight positive charges within a sequence of nine residues. It is noteworthy that a shorter peptide from Antennapedia deleted of the C-terminal Trp-Lys-Lys residues (i.e. lacking two positive charges) was not internalized (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Although the tryptophan residue was shown to play a role in the translocation event (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), an additional effect of the two Lys residues was not evaluated independently. The data reported with the Antennapedia peptide and those obtained in the present study with the Tat peptide strongly suggest that internalization could be linked to the presence of a high density of positive charges within a short sequence.Both the full-length Antennapedia (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and the Tat-(48–60) peptides (Fig. 1) are taken up efficiently at 4 °C. Likewise, several drugs known to interfere with caveolae-mediated uptake did not affect Tat uptake in our studies. Altogether, these studies strongly suggest that endocytosis is not involved in the uptake of these short basic peptides. On the other hand, the incubation of the Tat peptides with various unbound fluorochromes or with a non-permeant peptide did not induce their uptake. Taken together, these experiments do not support the involvement of a significant membrane disruption by Tat basic peptides or a well defined internalization pathway.The mechanism of translocation of the Tat basic peptide could be analogous to the model proposed for the Antennapedia homeodomain peptide (18Derossi D. Calvet S. Trembleau A. Brunissen A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-18193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). A tight ionic interaction between the basic groups of the peptide side chains and the negative charges of the phospholipid heads could induce a local invagination of the plasma membrane. The local reorganization of the phospholipid bilayer would then lead to the formation of inverted micelles with the peptide enclosed in the hydrophilic cavity and ultimately to the cytoplasmic release of the peptide. Because of the presence of a nuclear localization signal, the Tat peptide is rapidly translocated and concentrates in the nucleus. This would limit its release from the cell by the same mechanism. Further experiments are in progress to assess the reality of this working hypothesis. Additional studies will be required to define more accurately the structural requirements for this translocation activity and to uncover the mechanism by which Tat and possibly other basic peptides cross the plasma membrane.The translocation activity of such small Tat-derived peptides is powerful, as nuclear localization was observed after a few minutes of incubation with the cells. Internalization could be monitored in the micromolar concentration range by indirect immunofluorescence with peptide-specific antibodies or even at an order of magnitude lower by direct labeling of the peptide with a fluorochrome. Previous studies with the Antennapedia peptide made use of incubation times of several hours and routine concentrations of 20 μm (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). These differences were confirmed in a comparative study using the same fluorescein-labeling method for both peptides with Antennapedia peptide kindly provided by G. Chassaing and A. Prochiantz (CNRS URA1414, Ecole Normale Supérieure, Paris, France) (data not shown).The indirect immunodetection of the Tat peptide ensures that its ability to translocate through the plasma membrane was not altered by the reporter group itself. In most published studies, the possible influence of the fluorochrome reporter group or of the biotin-linking arm on the behavior of the peptide was not assessed. Along these lines, the biotinylation of a Tat peptide increased by 6-fold its uptake as compared with the non-biotinylated peptide (19Chen L., L. Frankel A.D. Harder J.L. Fawell S. Barsoum J. Anal. Biochem. 1995; 227: 168-175Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar).The internalization properties of these small Tat basic peptides could then be exploited for the intracellular delivery and for the nuclear targeting of conjugated non-permeant molecules. Ongoing work in our group aims at establishing whether the covalent conjugation through various linking arms of short Tat basic peptides to antisense oligonucleotides, to peptide nucleic acids, or to peptides will lead to their nuclear accumulation. Preliminary data indicate that a peptide which did not enter the cell by itself could be efficiently internalized when conjugated to the shorter Tat peptide.2Along the same lines the covalent linking of a 15-mer oligonucleotides to the 16-amino acid Antennapedia peptide led to improved intracellular delivery and to a significant increase in biological activity (20Allinquant B. Hantraye P. Mailleux P. Moya K. Bouillot C. Prochiantz A. J. Cell Biol. 1995; 128: 919-927Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar).Peptides bearing a high density of basic residues might also improve hybridization properties of antisense oligonucleotides. Previous studies have indeed described the enhanced affinities and kinetics of hybridization for its target sequence of an oligonucleotide covalently linked to a polyarginine sequence (21Wei Z. Tung C.H. Zhu T. Dickerhof W.A. Breslauer K.J. Georgopoulos D.E. Leibowitz M.J. Stein S. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 655-661Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). Several strategies have been proposed to improve the cellular uptake of proteins or nucleic acids. Some of these are based on the use of peptide sequences from proteins known to translocate through the plasma membrane. Along these lines, the HIV-1 Tat protein is able to cross the plasma membrane and to reach the cell nucleus to transactivate the viral genome (6Frankel A.D. Pabo C.O. Cell. 1988; 23: 1189-1193Abstract Full Text PDF Scopus (2287) Google Scholar, 7Mann D.A. Frankel A.D. EMBO J. 1991; 10: 1733-1739Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar, 8Vivès E. Charneau P. Van Rietschoten J. Rochat H. Bahraoui E. J. Virol. 1994; 68: 3343-3353Crossref PubMed Google Scholar). Moreover, a 35-amino acid peptide from Tat is able to promote the intracellular delivery of covalently bound proteins such as β-galactosidase, RNase A, or horseradish peroxidase in several cell lines and tissues (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). This peptide contains a cluster of basic amino acids extending from residues 49 to 58 and a sequence assumed to adopt an α-helical configuration (11Loret E.P. Vivès E. Ho P.S. Rochat H. Van Rietschoten J. Johnson Jr., W.C. Biochemistry. 1991; 30: 6013-6023Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar). The present study aimed at delineating whether shorter domains from this Tat peptide would be sufficient for cell internalization. The main determinant required for translocation was identified as the cluster of basic amino acids while the putative α-helix domain appeared dispensable. The full basic domain is required since a peptide deleted from the three arginine residues at its C-terminal end is not taken up by cells, even at high concentration. In keeping with a requirement for the full complement of positive charges in the Tat basic domain, any deletion or substitution of basic charges within the Tat-(48–60) peptide led to a reduced membrane translocating activity. 2E. Vivès, C. Granier, P. Prévot, and B. Lebleu (1997) Lett. Pept. Sci., in press. Shorter peptides such as Tat-(37–58) or Tat-(47–58) were less efficient carriers of proteins than the original 35-amino acid peptide (9Fawell S. Seery J. Daikh Y. Chen L.L. Pepinsky B. Barsoum J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 664-668Crossref PubMed Scopus (1096) Google Scholar). A steric hindrance between such short peptides and the bound protein could have reduced their availability for translocation. Along the same lines, a 16-amino acid peptide from the Antennapedia third helix homeodomain was described as having a good translocation ability through the plasma membrane, and it was initially assumed that its α-helix structure was important (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Likewise, the fusogenic properties of several viral peptides have been ascribed to α-helical determinants (17Gaudin Y. Ruigrok R.W.H. Brunner J. J. Gen. Virol. 1995; 76: 1541-1556Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). However, it was recently established that the insertion of proline residues, known to disrupt α-helical structures, did not abolish the translocation of the Antennapedia peptide (18Derossi D. Calvet S. Trembleau A. Brunissen A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-18193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). The sequence of this active Antennapedia peptide analogue is Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys. It contains five positive charges (two Arg and three Lys) within a linear sequence of seven residues at its C-terminal end. Similarly, the short Tat basic peptide described here contains eight positive charges within a sequence of nine residues. It is noteworthy that a shorter peptide from Antennapedia deleted of the C-terminal Trp-Lys-Lys residues (i.e. lacking two positive charges) was not internalized (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Although the tryptophan residue was shown to play a role in the translocation event (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), an additional effect of the two Lys residues was not evaluated independently. The data reported with the Antennapedia peptide and those obtained in the present study with the Tat peptide strongly suggest that internalization could be linked to the presence of a high density of positive charges within a short sequence. Both the full-length Antennapedia (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and the Tat-(48–60) peptides (Fig. 1) are taken up efficiently at 4 °C. Likewise, several drugs known to interfere with caveolae-mediated uptake did not affect Tat uptake in our studies. Altogether, these studies strongly suggest that endocytosis is not involved in the uptake of these short basic peptides. On the other hand, the incubation of the Tat peptides with various unbound fluorochromes or with a non-permeant peptide did not induce their uptake. Taken together, these experiments do not support the involvement of a significant membrane disruption by Tat basic peptides or a well defined internalization pathway. The mechanism of translocation of the Tat basic peptide could be analogous to the model proposed for the Antennapedia homeodomain peptide (18Derossi D. Calvet S. Trembleau A. Brunissen A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-18193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (954) Google Scholar). A tight ionic interaction between the basic groups of the peptide side chains and the negative charges of the phospholipid heads could induce a local invagination of the plasma membrane. The local reorganization of the phospholipid bilayer would then lead to the formation of inverted micelles with the peptide enclosed in the hydrophilic cavity and ultimately to the cytoplasmic release of the peptide. Because of the presence of a nuclear localization signal, the Tat peptide is rapidly translocated and concentrates in the nucleus. This would limit its release from the cell by the same mechanism. Further experiments are in progress to assess the reality of this working hypothesis. Additional studies will be required to define more accurately the structural requirements for this translocation activity and to uncover the mechanism by which Tat and possibly other basic peptides cross the plasma membrane. The translocation activity of such small Tat-derived peptides is powerful, as nuclear localization was observed after a few minutes of incubation with the cells. Internalization could be monitored in the micromolar concentration range by indirect immunofluorescence with peptide-specific antibodies or even at an order of magnitude lower by direct labeling of the peptide with a fluorochrome. Previous studies with the Antennapedia peptide made use of incubation times of several hours and routine concentrations of 20 μm (1Derossi D. Joliot H.A. Chassaing G. Prochiantz A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 10444-10450Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). These differences were confirmed in a comparative study using the same fluorescein-labeling method for both peptides with Antennapedia peptide kindly provided by G. Chassaing and A. Prochiantz (CNRS URA1414, Ecole Normale Supérieure, Paris, France) (data not shown). The indirect immunodetection of the Tat peptide ensures that its ability to translocate through the plasma membrane was not altered by the reporter group itself. In most published studies, the possible influence of the fluorochrome reporter group or of the biotin-linking arm on the behavior of the peptide was not assessed. Along these lines, the biotinylation of a Tat peptide increased by 6-fold its uptake as compared with the non-biotinylated peptide (19Chen L., L. Frankel A.D. Harder J.L. Fawell S. Barsoum J. Anal. Biochem. 1995; 227: 168-175Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar). The internalization properties of these small Tat basic peptides could then be exploited for the intracellular delivery and for the nuclear targeting of conjugated non-permeant molecules. Ongoing work in our group aims at establishing whether the covalent conjugation through various linking arms of short Tat basic peptides to antisense oligonucleotides, to peptide nucleic acids, or to peptides will lead to their nuclear accumulation. Preliminary data indicate that a peptide which did not enter the cell by itself could be efficiently internalized when conjugated to the shorter Tat peptide.2Along the same lines the covalent linking of a 15-mer oligonucleotides to the 16-amino acid Antennapedia peptide led to improved intracellular delivery and to a significant increase in biological activity (20Allinquant B. Hantraye P. Mailleux P. Moya K. Bouillot C. Prochiantz A. J. Cell Biol. 1995; 128: 919-927Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar). Peptides bearing a high density of basic residues might also improve hybridization properties of antisense oligonucleotides. Previous studies have indeed described the enhanced affinities and kinetics of hybridization for its target sequence of an oligonucleotide covalently linked to a polyarginine sequence (21Wei Z. Tung C.H. Zhu T. Dickerhof W.A. Breslauer K.J. Georgopoulos D.E. Leibowitz M.J. Stein S. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 655-661Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). We thank Dr. P. Prévot for fluorescence imaging and computerized analysis of pictures. We are grateful to Drs. J.-P. Briand and J. Neimark (IBMC, Strasbourg, France) as well as to J. Méry (CRBM, Montpellier, France) for the use of their peptide synthesizers and to Dr. C. Granier (U. Montpellier I) for the synthesis of several peptides, to J-A Fehrentz (U. Montpellier I) for HF facilities, to J.-P. Capony (CRBM, CNRS) for amino acid analysis, and to B. Calas (CRBM, CNRS) for electrospray ionization mass spectrometry. We also thank N. Mechti and other colleagues from the Institut de Génétique Moléculaire for fruitful discussions and I. Robbins for proofreading of the manuscript.

The distribution of 20 variable regions resulting from insertion-deletion events in the genomes of the tubercle bacilli has been evaluated in a total of 100 strains of Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium africanum , Mycobacterium canettii , Mycobacterium microti , and Mycobacterium bovis . This approach showed that the majority of these polymorphisms did not occur independently in the different strains of the M. tuberculosis complex but, rather, resulted from ancient, irreversible genetic events in common progenitor strains. Based on the presence or absence of an M. tuberculosis specific deletion (TbD1), M. tuberculosi s strains can be divided into ancestral and “modern” strains, the latter comprising representatives of major epidemics like the Beijing, Haarlem, and African M. tuberculosis clusters. Furthermore, successive loss of DNA, reflected by region of difference 9 and other subsequent deletions, was identified for an evolutionary lineage represented by M. africanum , M. microti , and M. bovis that diverged from the progenitor of the present M. tuberculosis strains before TbD1 occurred. These findings contradict the often-presented hypothesis that M. tuberculosis, the etiological agent of human tuberculosis evolved from M. bovis , the agent of bovine disease. M. canettii and ancestral M. tuberculosis strains lack none of these deleted regions, and, therefore, seem to be direct descendants of tubercle bacilli that existed before the M. africanum→M. bovis lineage separated from the M. tuberculosis lineage. This observation suggests that the common ancestor of the tubercle bacilli resembled M. tuberculosis or M. canettii and could well have been a human pathogen already.

Although large human populations have been safely immunized against tuberculosis with two live vaccines, Mycobacterium bovis BCG or Mycobacterium microti, the vole bacillus, the molecular basis for the avirulence of these vaccine strains remains unknown. Comparative genomics has identified a series of chromosomal deletions common to both virulent and avirulent species but only a single locus, RD1, that has been deleted from M. bovis BCG and M. microti. Restoration of RD1, by gene knock-in, resulted in a marked change in colonial morphology towards that of virulent tubercle bacilli. Three RD1-encoded proteins were localized in the cell wall, and two of them, the immunodominant T-cell antigens ESAT-6 and CFP-10, were also found in culture supernatants. The BCG::RD1 and M. microti::RD1 knock-ins grew more vigorously than controls in immunodeficient mice, inducing extensive splenomegaly and granuloma formation. Increased persistence and partial reversal of attenuation were observed when immunocompetent mice were infected with the BCG::RD1 knock-in, whereas BCG controls were cleared. Knocking-in five other RD loci did not affect the virulence of BCG. This study describes a genetic lesion that contributes to safety and opens new avenues for vaccine development.

Ammunition for the TB Wars Tuberculosis is a major human disease of global importance resulting from infection with the air-borne pathogen Mycobacterium tuberculosis , which is becoming increasingly resistant to all available drugs. An antituberculosis benzothiazinone compound kills mycobacterium in infected cells and in mice. Makarov et al. (p. 801 ) have identified a sulfur atom and nitro residues important for benzothiazinone's activity and used genetic methods and biochemical analysis to identify its target in blocking arabinogalactan biosynthesis during cell-wall synthesis. The compound affects the same pathway as ethambutol, and thus a benzothiazinone drug has the potential to become an important part of treatment of drug-resistant disease and, possibly, replace the less effective ethambutol in the primary treatment of tuberculosis.

The live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG (bacille Calmette-Guérin) and Mycobacterium microti both lack the potent, secreted T-cell antigens ESAT-6 (6-kDa early secretory antigenic target) and CFP-10 (10-kDa culture filtrate protein). This is a result of independent deletions in the region of deletion-1 (RD1) locus, which is intact in virulent members of the Mycobacterium tuberculosis complex. To increase their immunogenicity and protective capacity, we complemented both vaccines with different constructs containing the esxA and esxB genes, which encode ESAT-6 and CFP-10 respectively, as well as a variable number of flanking genes. Only reintroduction of the complete locus, comprising at least 11 genes, led to full secretion of the antigens and resulted in specific ESAT-6–dependent immune responses; this suggests that the flanking genes encode a secretory apparatus. Mice and guinea pigs vaccinated with the recombinant strain BCG::RD1-2F9 were better protected against challenge with M. tuberculosis, showing less severe pathology and reduced dissemination of the pathogen, as compared with control animals immunized with BCG alone.

ABSTRACT The 6-kDa early secreted antigenic target ESAT-6 and the 10-kDa culture filtrate protein CFP-10 of Mycobacterium tuberculosis are secreted by the ESX-1 system into the host cell and thereby contribute to pathogenicity. Although different studies performed at the organismal and cellular levels have helped to explain ESX-1-associated phenomena, not much is known about how ESAT-6 and CFP-10 contribute to pathogenesis at the molecular level. In this study we describe the interaction of both proteins with lipid bilayers, using biologically relevant liposomal preparations containing dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dimyristoylphosphatidylglycerol, and cholesterol. Using floatation gradient centrifugation, we demonstrate that ESAT-6 showed strong association with liposomes, and in particular with preparations containing DMPC and cholesterol, whereas the interaction of CFP-10 with membranes appeared to be weaker and less specific. Most importantly, binding to the biomembranes no longer occurred when the proteins were present as a 1:1 ESAT-6·CFP-10 complex. However, lowering of the pH resulted in dissociation of the protein complex and subsequent protein-liposome interaction. Finally, cryoelectron microscopy revealed that ESAT-6 destabilized and lysed liposomes, whereas CFP-10 did not. In conclusion, we propose that one of the main features of ESAT-6 in the infection process of M. tuberculosis is the interaction with biomembranes that occurs after dissociation from its putative chaperone CFP-10 under acidic conditions typically encountered in the phagosome.

A critical feature of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of human tuberculosis (TB), is its ability to survive and multiply within macrophages, making these host cells an ideal niche for persisting microbes. Killing the intracellular tubercle bacilli is a key requirement for efficient tuberculosis treatment, yet identifying potent inhibitors has been hampered by labor-intensive techniques and lack of validated targets. Here, we present the development of a phenotypic cell-based assay that uses automated confocal fluorescence microscopy for high throughput screening of chemicals that interfere with the replication of M. tuberculosis within macrophages. Screening a library of 57,000 small molecules led to the identification of 135 active compounds with potent intracellular anti-mycobacterial efficacy and no host cell toxicity. Among these, the dinitrobenzamide derivatives (DNB) showed high activity against M. tuberculosis, including extensively drug resistant (XDR) strains. More importantly, we demonstrate that incubation of M. tuberculosis with DNB inhibited the formation of both lipoarabinomannan and arabinogalactan, attributable to the inhibition of decaprenyl-phospho-arabinose synthesis catalyzed by the decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase DprE1/DprE2. Inhibition of this new target will likely contribute to new therapeutic solutions against emerging XDR-TB. Beyond validating the high throughput/content screening approach, our results open new avenues for finding the next generation of antimicrobials.

CITATION: Bitter, W., et al. 2009. Systematic genetic nomenclature for type VII secretion systems. PLoS Pathogens, 5(10): 1-6, doi: 10.1371/journal.ppat.1000507.

Analysis of mycobacterial strains that have lost their ability to cause disease is a powerful approach to identify yet unknown virulence determinants and pathways involved in tuberculosis pathogenesis. Two of the most widely used attenuated strains in the history of tuberculosis research are Mycobacterium bovis BCG (BCG) and Mycobacterium tuberculosis H37Ra (H37Ra), which both lost their virulence during in vitro serial passage. Whereas the attenuation of BCG is due mainly to loss of the ESAT-6 secretion system, ESX-1, the reason why H37Ra is attenuated remained unknown. However, here we show that a point mutation (S219L) in the predicted DNA binding region of the regulator PhoP is involved in the attenuation of H37Ra via a mechanism that impacts on the secretion of the major T cell antigen ESAT-6. Only H37Ra “knock-ins” that carried an integrated cosmid with the wild-type phoP gene from M. tuberculosis H37Rv showed changes in colony morphology, increased virulence, ESAT-6 secretion, and induction of specific T cell responses, whereas other H37Ra constructs did not. This finding established a link between the PhoP regulator and ESAT-6 secretion that opens exciting new perspectives for elucidating virulence regulation in M. tuberculosis.