Loss-of-function mutations in Park2, the gene coding for the ubiquitin ligase Parkin, are a significant cause of early onset Parkinson's disease. Although the role of Parkin in neuron maintenance is unknown, recent work has linked Parkin to the regulation of mitochondria. Its loss is associated with swollen mitochondria and muscle degeneration in Drosophila melanogaster, as well as mitochondrial dysfunction and increased susceptibility to mitochondrial toxins in other species. Here, we show that Parkin is selectively recruited to dysfunctional mitochondria with low membrane potential in mammalian cells. After recruitment, Parkin mediates the engulfment of mitochondria by autophagosomes and the selective elimination of impaired mitochondria. These results show that Parkin promotes autophagy of damaged mitochondria and implicate a failure to eliminate dysfunctional mitochondria in the pathogenesis of Parkinson's disease.

Loss-of-function mutations in PINK1 and Parkin cause parkinsonism in humans and mitochondrial dysfunction in model organisms. Parkin is selectively recruited from the cytosol to damaged mitochondria to trigger their autophagy. How Parkin recognizes damaged mitochondria, however, is unknown. Here, we show that expression of PINK1 on individual mitochondria is regulated by voltage-dependent proteolysis to maintain low levels of PINK1 on healthy, polarized mitochondria, while facilitating the rapid accumulation of PINK1 on mitochondria that sustain damage. PINK1 accumulation on mitochondria is both necessary and sufficient for Parkin recruitment to mitochondria, and disease-causing mutations in PINK1 and Parkin disrupt Parkin recruitment and Parkin-induced mitophagy at distinct steps. These findings provide a biochemical explanation for the genetic epistasis between PINK1 and Parkin in Drosophila melanogaster. In addition, they support a novel model for the negative selection of damaged mitochondria, in which PINK1 signals mitochondrial dysfunction to Parkin, and Parkin promotes their elimination.

Protein aggregates and damaged organelles are tagged with ubiquitin chains to trigger selective autophagy. To initiate mitophagy, the ubiquitin kinase PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate the ubiquitin ligase parkin, which builds ubiquitin chains on mitochondrial outer membrane proteins, where they act to recruit autophagy receptors. Using genome editing to knockout five autophagy receptors in HeLa cells, here we show that two receptors previously linked to xenophagy, NDP52 and optineurin, are the primary receptors for PINK1- and parkin-mediated mitophagy. PINK1 recruits NDP52 and optineurin, but not p62, to mitochondria to activate mitophagy directly, independently of parkin. Once recruited to mitochondria, NDP52 and optineurin recruit the autophagy factors ULK1, DFCP1 and WIPI1 to focal spots proximal to mitochondria, revealing a function for these autophagy receptors upstream of LC3. This supports a new model in which PINK1-generated phospho-ubiquitin serves as the autophagy signal on mitochondria, and parkin then acts to amplify this signal. This work also suggests direct and broader roles for ubiquitin phosphorylation in other autophagy pathways. The PINK1 ubiquitin kinase is shown to recruit the two autophagy receptors NDP52 and OPTN to mitochondria to activate mitophagy directly, independently of the ubiquitin ligase parkin; once recruited to mitochondria, NDP52 and OPTN recruit autophagy initiation components, and parkin may amplify the phospho-ubiquitin signal generated by PINK1, resulting in robust autophagy induction. As in other forms of selective autophagy, during mitophagy the damaged cargo — the mitochondrion — is tagged with ubiquitin chains for recognition and subsequent degradation. Specifically, the enzyme PINK1 phosphorylates ubiquitin as part of the process to activate the ubiquitin ligase enzyme parkin. Consequently, parkin can build ubiquitin chains on mitochondrial outer membrane proteins to recruit autophagy receptors. Richard Youle and colleagues report an additional layer of regulatory complexity in this pathway, with a cellular role for phosphorylated ubiquitin. Using genome editing to knockout multiple autophagy receptors, the authors find that PINK1 recruits only two such receptors, NDP52 and optineurin, to mitochondria to directly activate mitophagy, independent of parkin. NDP52 and optineurin then recruit other autophagy components. These observations call for a revision of the current model of the role of parkin in mitophagy, suggesting that it amplifies the phospho-ubiquitin signal generated by PINK1 to signal autophagy.

Bax, a member of the Bcl-2 protein family, accelerates apoptosis by an unknown mechanism. Bax has been recently reported to be an integral membrane protein associated with organelles or bound to organelles by Bcl-2 or a soluble protein found in the cytosol. To explore Bcl-2 family member localization in living cells, the green fluorescent protein (GFP) was fused to the NH2 termini of Bax, Bcl-2, and Bcl-XL. Confocal microscopy performed on living Cos-7 kidney epithelial cells and L929 fibroblasts revealed that GFP–Bcl-2 and GFP–Bcl-XL had a punctate distribution and colocalized with a mitochondrial marker, whereas GFP–Bax was found diffusely throughout the cytosol. Photobleaching analysis confirmed that GFP–Bax is a soluble protein, in contrast to organelle-bound GFP–Bcl-2. The diffuse localization of GFP–Bax did not change with coexpression of high levels of Bcl-2 or Bcl-XL. However, upon induction of apoptosis, GFP–Bax moved intracellularly to a punctate distribution that partially colocalized with mitochondria. Once initiated, this Bax movement was complete within 30 min, before cellular shrinkage or nuclear condensation. Removal of a COOH-terminal hydrophobic domain from GFP–Bax inhibited redistribution during apoptosis and inhibited the death-promoting activity of both Bax and GFP– Bax. These results demonstrate that in cells undergoing apoptosis, an early, dramatic change occurs in the intracellular localization of Bax, and this redistribution of soluble Bax to organelles appears important for Bax to promote cell death.

In healthy cells, fusion and fission events participate in regulating mitochondrial morphology. Disintegration of the mitochondrial reticulum into multiple punctiform organelles during apoptosis led us to examine the role of Drp1, a dynamin-related protein that mediates outer mitochondrial membrane fission. Upon induction of apoptosis, Drp1 translocates from the cytosol to mitochondria, where it preferentially localizes to potential sites of organelle division. Inhibition of Drp1 by overexpression of a dominant-negative mutant counteracts the conversion to a punctiform mitochondrial phenotype, prevents the loss of the mitochondrial membrane potential and the release of cytochrome c, and reveals a reproducible swelling of the organelles. Remarkably, inhibition of Drp1 blocks cell death, implicating mitochondrial fission as an important step in apoptosis.

Damage to mitochondria can lead to the depolarization of the inner mitochondrial membrane, thereby sensitizing impaired mitochondria for selective elimination by autophagy. However, fusion of uncoupled mitochondria with polarized mitochondria can compensate for damage, reverse membrane depolarization, and obviate mitophagy. Parkin, an E3 ubiquitin ligase that is mutated in monogenic forms of Parkinson’s disease, was recently found to induce selective autophagy of damaged mitochondria. Here we show that ubiquitination of mitofusins Mfn1 and Mfn2, large GTPases that mediate mitochondrial fusion, is induced by Parkin upon membrane depolarization and leads to their degradation in a proteasome- and p97-dependent manner. p97, a AAA+ ATPase, accumulates on mitochondria upon uncoupling of Parkin-expressing cells, and both p97 and proteasome activity are required for Parkin-mediated mitophagy. After mitochondrial fission upon depolarization, Parkin prevents or delays refusion of mitochondria, likely by the elimination of mitofusins. Inhibition of Drp1-mediated mitochondrial fission, the proteasome, or p97 prevents Parkin-induced mitophagy.

PINK1 is a mitochondrial kinase mutated in some familial cases of Parkinson’s disease. It has been found to work in the same pathway as the E3 ligase Parkin in the maintenance of flight muscles and dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster and to recruit cytosolic Parkin to mitochondria to mediate mitophagy in mammalian cells. Although PINK1 has a predicted mitochondrial import sequence, its cellular and submitochondrial localization remains unclear in part because it is rapidly degraded. In this study, we report that the mitochondrial inner membrane rhomboid protease presenilin-associated rhomboid-like protein (PARL) mediates cleavage of PINK1 dependent on mitochondrial membrane potential. In the absence of PARL, the constitutive degradation of PINK1 is inhibited, stabilizing a 60-kD form inside mitochondria. When mitochondrial membrane potential is dissipated, PINK1 accumulates as a 63-kD full-length form on the outer mitochondrial membrane, where it can recruit Parkin to impaired mitochondria. Thus, differential localization to the inner and outer mitochondrial membranes appears to regulate PINK1 stability and function.

Bcl-2, Bcl-X(L), and Bax are members of the Bcl-2 family that play key roles in the regulation of apoptosis. These proteins are believed to be membrane bound and their ability to undergo both homodimerization and heterodimerization has been proposed to regulate apoptosis. Herein we report that in murine thymocytes, Bcl-2 is exclusively membrane-bound, whereas Bax is present predominantly in the cytosol and Bcl-X(L) is present in both soluble and membrane-bound forms. Induction of apoptosis in murine thymocytes by dexamethasone or gamma-irradiation shifts the subcellular locations of Bax and Bcl-X(L) from soluble to membrane-bound forms. A similar shift in the localization of Bax from the cytosol to membranes was observed in HL-60 leukemia cells upon induction of apoptosis by staurosporine. Inhibition of apoptosis with cycloheximide inhibits the movement of Bax and Bcl-X(L) in thymocytes from the cytosol into membranes induced by dexamethasone treatment. These movements may represent an important step in the pathway by which members of this family regulate apoptosis.

PINK1 kinase activates the E3 ubiquitin ligase Parkin to induce selective autophagy of damaged mitochondria. However, it has been unclear how PINK1 activates and recruits Parkin to mitochondria. Although PINK1 phosphorylates Parkin, other PINK1 substrates appear to activate Parkin, as the mutation of all serine and threonine residues conserved between Drosophila and human, including Parkin S65, did not wholly impair Parkin translocation to mitochondria. Using mass spectrometry, we discovered that endogenous PINK1 phosphorylated ubiquitin at serine 65, homologous to the site phosphorylated by PINK1 in Parkin's ubiquitin-like domain. Recombinant TcPINK1 directly phosphorylated ubiquitin and phospho-ubiquitin activated Parkin E3 ubiquitin ligase activity in cell-free assays. In cells, the phosphomimetic ubiquitin mutant S65D bound and activated Parkin. Furthermore, expression of ubiquitin S65A, a mutant that cannot be phosphorylated by PINK1, inhibited Parkin translocation to damaged mitochondria. These results explain a feed-forward mechanism of PINK1-mediated initiation of Parkin E3 ligase activity.

Although serum from patients with Parkinson’s disease contains elevated levels of numerous pro-inflammatory cytokines including IL-6, TNF, IL-1β, and IFNγ, whether inflammation contributes to or is a consequence of neuronal loss remains unknown1. Mutations in parkin, an E3 ubiquitin ligase, and PINK1, a ubiquitin kinase, cause early onset Parkinson’s disease2,3. Both PINK1 and parkin function within the same biochemical pathway and remove damaged mitochondria from cells in culture and in animal models via mitophagy, a selective form of autophagy4. The in vivo role of mitophagy, however, is unclear, partly because mice that lack either PINK1 or parkin have no substantial Parkinson’s-disease-relevant phenotypes5–7. Mitochondrial stress can lead to the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) that can activate innate immunity8–12, suggesting that mitophagy may mitigate inflammation. Here we report a strong inflammatory phenotype in both Prkn −/− and Pink1 −/− mice following exhaustive exercise and in Prkn −/−;mutator mice, which accumulate mutations in mitochondrial DNA (mtDNA)13,14. Inflammation resulting from either exhaustive exercise or mtDNA mutation is completely rescued by concurrent loss of STING, a central regulator of the type I interferon response to cytosolic DNA15,16. The loss of dopaminergic neurons from the substantia nigra pars compacta and the motor defect observed in aged Prkn −/−;mutator mice are also rescued by loss of STING, suggesting that inflammation facilitates this phenotype. Humans with mono- and biallelic PRKN mutations also display elevated cytokines. These results support a role for PINK1- and parkin-mediated mitophagy in restraining innate immunity. Acute and chronic mitochondrial stress in mice require PINK1 and parkin to restrain STING-mediated innate immunity.