Summary Metabolic dysregulation in multiple tissues alters glucose homeostasis and influences risk for type 2 diabetes (T2D). To identify pathways and tissues influencing T2D-relevant glycemic traits (fasting glucose [FG], fasting insulin [FI], two-hour glucose [2hGlu] and glycated hemoglobin [HbA1c]), we investigated associations of exome-array variants in up to 144,060 individuals without diabetes of multiple ancestries. Single-variant analyses identified novel associations at 21 coding variants in 18 novel loci, whilst gene-based tests revealed signals at two genes, TF (HbA1c) and G6PC (FG, FI). Pathway and tissue enrichment analyses of trait-associated transcripts confirmed the importance of liver and kidney for FI and pancreatic islets for FG regulation, implicated adipose tissue in FI and the gut in 2hGlu, and suggested a role for the non-endocrine pancreas in glucose homeostasis. Functional studies demonstrated that a novel FG/FI association at the liver-enriched G6PC transcript was driven by multiple rare loss-of-function variants. The FG/HbA1c-associated, islet-specific G6PC2 transcript also contained multiple rare functional variants, including two alleles within the same codon with divergent effects on glucose levels. Our findings highlight the value of integrating genomic and functional data to maximize biological inference. Highlights 23 novel coding variant associations (single-point and gene-based) for glycemic traits 51 effector transcripts highlighted different pathway/tissue signatures for each trait The exocrine pancreas and gut influence fasting and 2h glucose, respectively Multiple variants in liver-enriched G6PC and islet-specific G6PC2 influence glycemia

Abstract The tumor suppressor phosphatase and tensin homolog (PTEN) negatively regulates the insulin signaling pathway. Germline PTEN pathogenic variants cause PTEN Hamartoma Tumor Syndrome (PHTS), associated with lipoma development in children. It remains unclear which mechanisms trigger this aberrant adipose tissue growth. Adipocyte progenitor cells (APCs) lose their capacity to differentiate into adipocytes during continuous culture, while APCs from PHTS patients’ lipomas retain their adipogenic potential over a prolonged period. To investigate the role of PTEN in adipose tissue development we performed functional assays and RNA sequencing of control and PTEN knockdown APCs. Reduction of PTEN levels using siRNA or CRISPR lead to an enhanced proliferation and differentiation of APCs. FOXO1 was downregulated on the mRNA level while inactivation through phosphorylation increased. FOXO1 phosphorylation initiates the expression of the lipogenesis activating transcription factor SREBP1. SREBP1 levels were higher after PTEN knockdown and may account for the enhanced adipogenesis. To validate this we overexpressed constitutively active FOXO1 in PTEN CRISPR cells and found reduced adipogenesis, accompanied by a SREBP1 downregulation. We observed that PTEN levels were upregulated during long term culture of wild type APCs. PTEN CRISPR cells showed less senescence compared to controls and the senescence marker CDKN1A (p21) was downregulated in PTEN knockdown cells. Cellular senescence was the most significantly enriched pathway found in RNA sequencing of PTEN knockdown vs. control cells. These results provide evidence that PTEN is involved in the regulation of APCs proliferation, differentiation and senescence, thereby contributing to aberrant adipose tissue growth in PHTS patients.

Background: There is increasing evidence for the role of impaired intestinal permeability in obesity and associated metabolic diseases. Zonulin is an established serum marker for intestinal permeability and identical to pre-haptoglobin2. Here, we aimed to investigate the relationship between circulating zonulin and metabolic traits related to obesity. Methods: Serum zonulin was measured by using a widely used commercial ELISA kit in 376 subjects from the metabolically well-characterized cohort of Sorbs from Germany. In addition, haptoglobin genotype was determined in DNA samples from all study subjects. Results: As zonulin concentrations did not correlate to the haptoglobin genotypes, we investigated the specificity of the zonulin ELISA assay using antibody capture experiments, mass spectrometry, and Western blot analysis. Using serum samples that gave the highest or lowest ELISA signals, we detected several proteins that are likely to be captured by the antibody in the present kit. However, none of these proteins corresponds to pre-haptoglobin2. We used increasing concentrations of recombinant pre-haptoglobin2 and complement C3 as one of the representative captured proteins and the ELISA kit did not detect either. Western blot analysis using both the polyclonal antibodies used in this kit and monoclonal antibodies rose against zonulin showed a similar protein recognition pattern but with different intensity of detection. The protein(s) measured using the ELISA kit was (were) significantly increased in patients with diabetes and obesity and correlated strongly with markers of the lipid and glucose metabolism. Combining mass spectrometry and Western blot analysis using the polyclonal antibodies used in the ELISA kit, we identified properdin as another member of the zonulin family. Conclusion: Our study suggests that the zonulin ELISA does not recognize pre-haptoglobin2, rather structural (and possibly functional) analog proteins belonging to the mannose-associated serine protease family, with properdin being the most likely possible candidate.

Birth weight (BW) variation is influenced by fetal and maternal genetic and non-genetic factors, and has been reproducibly associated with future cardio-metabolic health outcomes. These associations have been proposed to reflect the lifelong consequences of an adverse intrauterine environment. In earlier work, we demonstrated that much of the negative correlation between BW and adult cardio-metabolic traits could instead be attributable to shared genetic effects. However, that work and other previous studies did not systematically distinguish the direct effects of an individual's own genotype on BW and subsequent disease risk from indirect effects of their mother's correlated genotype, mediated by the intrauterine environment. Here, we describe expanded genome-wide association analyses of own BW (n=321,223) and offspring BW (n=230,069 mothers), which identified 278 independent association signals influencing BW (214 novel). We used structural equation modelling to decompose the contributions of direct fetal and indirect maternal genetic influences on BW, implicating fetal- and maternal-specific mechanisms. We used Mendelian randomization to explore the causal relationships between factors influencing BW through fetal or maternal routes, for example, glycemic traits and blood pressure. Direct fetal genotype effects dominate the shared genetic contribution to the association between lower BW and higher type 2 diabetes risk, whereas the relationship between lower BW and higher later blood pressure (BP) is driven by a combination of indirect maternal and direct fetal genetic effects: indirect effects of maternal BP-raising genotypes act to reduce offspring BW, but only direct fetal genotype effects (once inherited) increase the offspring's later BP. Instrumental variable analysis using maternal BW-lowering genotypes to proxy for an adverse intrauterine environment provided no evidence that it causally raises offspring BP. In successfully separating fetal from maternal genetic effects, this work represents an important advance in genetic studies of perinatal outcomes, and shows that the association between lower BW and higher adult BP is attributable to genetic effects, and not to intrauterine programming.

Body fat distribution is a heritable risk factor for a range of adverse health consequences, including hyperlipidemia and type 2 diabetes. To identify protein-coding variants associated with body fat distribution, assessed by waist-to-hip ratio adjusted for body mass index, we analyzed 228,985 predicted coding and splice site variants available on exome arrays in up to 344,369 individuals from five major ancestries for discovery and 132,177 independent European-ancestry individuals for validation. We identified 15 common (minor allele frequency, MAF ≥ 5%) and 9 low frequency or rare (MAF < 5%) coding variants that have not been reported previously. Pathway/gene set enrichment analyses of all associated variants highlight lipid particle, adiponectin level, abnormal white adipose tissue physiology, and bone development and morphology as processes affecting fat distribution and body shape. Furthermore, the cross-trait associations and the analyses of variant and gene function highlight a strong connection to lipids, cardiovascular traits, and type 2 diabetes. In functional follow-up analyses, specifically in Drosophila RNAi-knockdown crosses, we observed a significant increase in the total body triglyceride levels for two genes (DNAH10 and PLXND1). By examining variants often poorly tagged or entirely missed by genome-wide association studies, we implicate novel genes in fat distribution, stressing the importance of interrogating low-frequency and protein-coding variants.

Identification of coding variant associations for complex diseases offers a direct route to biological insight, but is dependent on appropriate inference concerning the causal impact of those variants on disease risk. We aggregated coding variant data for 81,412 type 2 diabetes (T2D) cases and 370,832 controls of diverse ancestry, identifying 40 distinct coding variant association signals (at 38 loci) reaching significance (p<2.2x10-7). Of these, 16 represent novel associations mapping outside known genome-wide association study (GWAS) signals. We make two important observations. First, despite a threefold increase in sample size over previous efforts, only five of the 40 signals are driven by variants with minor allele frequency <5%, and we find no evidence for low-frequency variants with allelic odds ratio >1.29. Second, we used GWAS data from 50,160 T2D cases and 465,272 controls of European ancestry to fine-map these associated coding variants in their regional context, with and without additional weighting to account for the global enrichment of complex trait association signals in coding exons. At the 37 signals for which we attempted fine-mapping, we demonstrate convincing support (posterior probability >80% under the 'annotation-weighted' model) that coding variants are causal for the association at 16 (including novel signals involving POC5 p.His36Arg, ANKH p.Arg187Gln, WSCD2 p.Thr113Ile, PLCB3 p.Ser778Leu, and PNPLA3 p.Ile148Met). However, at 13 of the 37 loci, the associated coding variants represent 'false leads' and naïve analysis could have led to an erroneous inference regarding the effector transcript mediating the signal. Accurate identification of validated targets is dependent on correct specification of the contribution of coding and non-coding mediated mechanisms at associated loci.

We report genome-wide ancient DNA from 44 ancient Near Easterners ranging in time between ~12,000-1,400 BCE, from Natufian hunter-gatherers to Bronze Age farmers. We show that the earliest populations of the Near East derived around half their ancestry from a 'Basal Eurasian' lineage that had little if any Neanderthal admixture and that separated from other non-African lineages prior to their separation from each other. The first farmers of the southern Levant (Israel and Jordan) and Zagros Mountains (Iran) were strongly genetically differentiated, and each descended from local hunter-gatherers. By the time of the Bronze Age, these two populations and Anatolian-related farmers had mixed with each other and with the hunter-gatherers of Europe to drastically reduce genetic differentiation. The impact of the Near Eastern farmers extended beyond the Near East: farmers related to those of Anatolia spread westward into Europe; farmers related to those of the Levant spread southward into East Africa; farmers related to those from Iran spread northward into the Eurasian steppe; and people related to both the early farmers of Iran and to the pastoralists of the Eurasian steppe spread eastward into South Asia.