ABSTRACT The Brazilian buffy-tufted-ear marmoset ( Callithrix aurita ), one of the world’s most endangered primates, is threatened by anthropogenic hybridization with exotic, invasive marmoset species. As there are few genetic data available for C. aurita , we developed a PCR-free protocol with minimal technical requirements to rapidly generate genomic data with genomic skimming and portable nanopore sequencing. With this direct DNA sequencing approach, we successfully determined the complete mitogenome of a marmoset that we initially identified as C. aurita . The obtained nanopore-assembled sequence was highly concordant with a Sanger sequenced version of the same mitogenome. Phylogenetic analyses unexpectedly revealed that our specimen was a cryptic hybrid, with a C. aurita phenotype and C. penicillata mitogenome lineage. We also used publicly available mitogenome data to determine diversity estimates for C. aurita and three other marmoset species. Mitogenomics holds great potential to address deficiencies in genomic data for endangered, non-model species such as C. aurita . However, we discuss why mitogenomic approaches should be used in conjunction with other data for marmoset species identification. Finally, we discuss the utility and implications of our results and genomic skimming/nanopore approach for conservation and evolutionary studies of C. aurita and other marmosets.

Abstract Callithrix marmosets are a relatively young primate radiation, whose phylogeny is not yet fully resolved. These primates are naturally para- and allopatric, but three species with highly invasive potential have been introduced into the southeastern Brazilian Atlantic Forest by the pet trade. There, these species hybridize with each other and endangered, native congeners. We aimed here to reconstruct a robust Callithrix phylogeny and divergence time estimates, and identify the biogeographic origins of autochthonous and allochthonous Callithrix mitogenome lineages. We sequenced 49 mitogenomes from four species ( C. aurita, C. geoffroyi, C. jacchus, C. penicillata ) and anthropogenic hybrids ( C. aurita x Callithrix sp., C. penicillata x C. jacchus, Callithrix sp. x Callithrix sp., C. penicillata x C. geoffroyi ) via Sanger and whole genome sequencing. We combined these data with previously published Callithrix mitogenomes to analyze five Callithrix species in total. Results We report the complete sequence and organization of the C. aurita mitogenome. Phylogenetic analyses showed that C. aurita was the first to diverge within Callithrix 3.54 million years ago (Ma), while C. jacchus and C. penicillata lineages diverged most recently 0.5 Ma as sister clades. MtDNA clades of C. aurita, C. geoffroyi , and C. penicillata show intraspecific geographic structure, but C. penicillata clades appear polyphyletic. Hybrids, which were identified by phenotype, possessed mainly C. penicillata or C. jacchus mtDNA haplotypes. The biogeographic origins of mtDNA haplotypes from hybrid and allochthonous Callithrix were broadly distributed across natural Callithrix ranges. Our phylogenetic results also evidence introgression of C. jacchus mtDNA into C. aurita . Conclusion Our robust Callithrix mitogenome phylogeny shows C. aurita lineages as basal and C. jacchus lineages among the most recent within Callithrix . We provide the first evidence that parental mtDNA lineages of anthropogenic hybrid and allochthonous marmosets are broadly distributed inside and outside of the Atlantic Forest. We also show evidence of cryptic hybridization between allochthonous Callithrix and autochthonous C. aurita . Our results encouragingly show that further development of genomic resources will allow to more clearly elucidate Callithrix evolutionary relationships and understand the dynamics of Callithrix anthropogenic introductions into the Brazilian Atlantic Forest.

Microbiome studies show that host taxon, diet, and environment influence gut bacteria. However, these factors are rarely studied in animal hybrids and exudivores (which nutritionally exploit indigestible oligosaccharides). To investigate the effects of host taxon, hybridization, and environment on gut microbiota, we conducted 16S V4 ribosomal sequencing of the gut microbiome of marmosets (Callithrix), non-human primate (NHP) specialist exudivores that also hybridize. We sampled 59 wild, translocated, and captive pure and hybrid Callithrix, including endangered C. aurita. Gut microbiome diversity differed significantly between hybrids and non-hybrids, but host environment had the strongest overall effect on the gut microbiome. Captive marmosets showed relatively reduced gut microbiome diversity. Wild Callithrix had the highest relative abundance of Bifidobacterium, which process host-indigestible carbohydrates, while captive marmosets had the highest relative abundance of Enterobacteriaceae, a family containing several pathogenic bacteria. The wild marmoset gut microbiome was enriched predictively for carbohydrate metabolism functions, while that of captive marmosets was enriched for nucleotide and amino acid metabolism function. Our findings show that carbohydrate metabolism is integral to the composition and function of the wild exudivore gut microbiome. Further, captivity perturbs the exudivore gut microbiome, raising implications for captive host health and endangered exudivore conservation.

Abstract Background Hybrids are expected to show greater phenotypic variation than their parental species, yet how hybrid phenotype expression varies with genetic distances in closely-related parental species remains surprisingly understudied. Here we study pelage and morphometric trait variation in anthropogenic hybrids between four species of Brazilian Callithrix marmosets, a relatively recent primate radiation. Marmoset species are distinguishable by pelage phenotype and level of morphological specialization for eating tree exudates. Here, we (1) describe qualitative phenotypic pelage differences between parental species and hybrids; (2) test whether significant quantitative differences exist between parental and hybrid morphometric phenotypes; and (3) determine which hybrid morphometic traits show heterosis, dysgenesis, trangression, or intermediacy relative to the parental trait. For morphometric traits, we investigated both cranial and post-cranial traits, particularly as most hybrid morphological studies focus on the former instead of the latter. Finally, we estimate mitogenomic distances between marmoset species from previously published data. Results Hybrid facial and overall body pelage variation reflected coloration and patterns seen in parental species. In morphometric traits, C. jacchus and C. penicillata were the most similar to each other, while C. aurita was the most distinct, and C. geoffroyi trait measures fell between these other species. Most traits in C. jacchus x C. penicillata hybrids showed either heterosis or were intermediate relative to the parental trait values. We observed heterosis and dygenesis in traits of C. penicillata x C. geoffroyi hybrids. Trangressive segregation was observed in hybrids of C. aurita and the other species. These hybrids were also C. aurita -like for a number of traits. Genetic distance was closest between C. jacchus and C. penicillata and farthest between C. aurita and the other species. Conclusion We attributed significant phenotypic differences between marmoset species to differences in morphological exudivory specialization in these species. Our results suggest that intermediate hybrid traits relative to the parental trait values are more likely in crosses between species with relatively lesser genetic distance. More extreme phenotypic variation is more likely in parental species with greater genetic distance, with transgressive traits appearing in hybrids of the most genetically distant parental species. We further suggest that that less developmental disturbances can be expected in hybrids of more recently diverged parental species.