Recent advances in human pluripotent stem cell (hPSC) differentiation protocols have generated insulin-producing cells resembling pancreatic β cells. While these stem cell-derived β (SC-β) cells are capable of undergoing glucose-stimulated insulin secretion (GSIS), insulin secretion per cell remains low compared with islets and cells lack dynamic insulin release. Herein, we report a differentiation strategy focused on modulating transforming growth factor β (TGF-β) signaling, controlling cellular cluster size, and using an enriched serum-free media to generate SC-β cells that express β cell markers and undergo GSIS with first- and second-phase dynamic insulin secretion. Transplantation of these cells into mice greatly improves glucose tolerance. These results reveal that specific time frames for inhibiting and permitting TGF-β signaling are required during SC-β cell differentiation to achieve dynamic function. The capacity of these cells to undergo GSIS with dynamic insulin release makes them a promising cell source for diabetes cellular therapy.

Generation of pancreatic β cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) holds promise as a cell replacement therapy for diabetes. In this study, we establish a link between the state of the actin cytoskeleton and the expression of pancreatic transcription factors that drive pancreatic lineage specification. Bulk and single-cell RNA sequencing demonstrated that different degrees of actin polymerization biased cells toward various endodermal lineages and that conditions favoring a polymerized cytoskeleton strongly inhibited neurogenin 3-induced endocrine differentiation. Using latrunculin A to depolymerize the cytoskeleton during endocrine induction, we developed a two-dimensional differentiation protocol for generating human pluripotent stem-cell-derived β (SC-β) cells with improved in vitro and in vivo function. SC-β cells differentiated from four hPSC lines exhibited first- and second-phase dynamic glucose-stimulated insulin secretion. Transplantation of islet-sized aggregates of these cells rapidly reversed severe preexisting diabetes in mice at a rate close to that of human islets and maintained normoglycemia for at least 9 months. Generation of pancreatic β cells from stem cells is enhanced by manipulating the cytoskeleton.

Abstract Transplantation of insulin-secreting β-cells differentiated from human pluripotent stem cells holds great potential as a cell therapy for treating insulin-dependent diabetes. While these stem cell-derived islets (SC-islets) are able to reverse diabetes in animal models, they are not fully equivalent to their in vivo counterparts. To better define the state of the cell types generated within these SC-islets and provide a resource for identifying deficiencies in lineage specification, we used single-cell multiomic sequencing to simultaneously measure the chromatin accessibility and transcriptional profiles of SC-islets at multiple time points as well as primary human islets. The integrated analysis of both the transcriptional and chromatin landscape for each cell provided greater resolution for defining cell identity, allowing us to derive novel gene lists for identifying each islet cell type. Furthermore, this multiomic analysis revealed that the difference between SC-β cells and enterochromaffin-like cells, which are a major off-target from in vitro differentiation, is a gradient of progressive cell states rather than a stark difference in identity. The chromatin landscape of primary human islets was much more restricted, suggesting that stem cell-derived cells are not fully locked into their cell fate. While long term culture of SC-islets both in vitro and in vivo does close overall chromatin state, only in vivo transplantation directs cells toward their correct identities. Collectively, our multiomic analysis demonstrates that both the chromatin and transcriptional landscapes play significant roles in islet cell identity, and these data can be used as a resource to identify specific deficiencies in the chromatin and transcriptional state of SC-islet cell types.

Abstract Diabetes involves the death or dysfunction of pancreatic β-cells. Analysis of bulk sequencing from human samples and studies using in vitro and in vivo models suggest that endoplasmic reticulum and inflammatory signaling play an important role in diabetes progression. To better characterize cell type-specific stress response, we perform multiplexed single-cell RNA sequencing to define the transcriptional signature of primary human islet cells exposed to endoplasmic reticulum and inflammatory stress. Through comprehensive pair-wise analysis of stress responses across pancreatic endocrine and exocrine cell types, we define changes in gene expression for each cell type under different diabetes-associated stressors. We find that β-, α-, and ductal cells have the greatest transcriptional response. We utilize stem cell-derived islets to study islet health through the candidate gene CIB1 , which was upregulated under stress in primary human islets. Our findings provide insights into cell type-specific responses to diabetes-associated stress and establish a resource to identify targets for diabetes therapeutics.

Abstract Wolfram syndrome is a rare genetic disorder largely caused by pathogenic variants in the WFS1 gene and manifested by diabetes mellitus, optic nerve atrophy, and progressive neurodegeneration. Recent genetic and clinical findings have revealed Wolfram syndrome as a spectrum disorder. Therefore, a genotype-phenotype correlation analysis is needed for diagnosis and therapeutic development. Here, we focus on the WFS1 c.1672C>T, p.R558C variant which is highly prevalent in the Ashkenazi-Jewish population. Clinical investigation indicates that subjects carrying the homozygous WFS1 c.1672C>T, p.R558C variant show mild forms of Wolfram syndrome phenotypes. Expression of WFS1 p.R558C is more stable compared to the other known recessive pathogenic variants associated with Wolfram syndrome. Stem cell-derived islets (SC-islets) homozygous for WFS1 c.1672C>T variant recapitulates genotype-related Wolfram phenotypes, which are milder than those of SC-islets with compound heterozygous WFS1 c.1672C>T (p.R558C), c.2654C>T (p.P885L). Enhancing residual WFS1 function by a combination treatment of chemical chaperones, sodium 4-phenylbutyrate (4-PBA) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), mitigates detrimental effects caused by the WFS1 c.1672C>T, p.R558C variant and restored SC-islet function. Thus, the WFS1 c.1672C>T, p.R558C variant causes a mild form of Wolfram syndrome phenotypes, which can be remitted with a combination treatment of chemical chaperones. We demonstrate that our patient stem cell-derived disease model provides a valuable platform for further genotype-phenotype analysis and therapeutic development for Wolfram syndrome. One sentence summary Development of personalized therapy for Wolfram syndrome using genetics and iPSC model.

Differentiation of stem cells into functional replacement cells and tissues is a major goal of the regenerative medicine field. However, one limitation has been organization of differentiated cells into multi-cellular, three-dimensional assemblies. The islets of Langerhans contain many endocrine and non-endocrine cell types, such as insulin-producing β cells and endothelial cells. Transplantation of exogenous islets into diabetic patients can serve as a cell replacement therapy, replacing the need for patients to inject themselves with insulin, but the number of available islets from cadaveric donors is low. We have developed a strategy of assembling human embryonic stem cell-derived β cells with endothelial cells into three-dimensional aggregates on a hydrogel. The resulting islet organoids express β cell markers and are functional, capable of undergoing glucose-stimulated insulin secretion. These results provide a platform for evaluating the effects of the islet tissue microenvironment on human embryonic stem cell-derived β cells and other islet endocrine cells to develop tissue engineered islets.

Abstract Background Adoptive immunotherapy using natural killer (NK) cells has attracted considerable interest in numerous clinical trials targeting both hematological and solid tumors. Traditionally, NK cells are primarily derived from either peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). However, these methods can lead to variability and heterogeneity within the NK cell population. In contrast, induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived NK (iNK) cells provide a more controlled and uniform cellular population, suitable for large-scale clinical applications. This makes iNK cells a promising option for developing “off-the-shelf” immunotherapeutic products. Nevertheless, current NK cell differentiation protocols, which rely on embryoid body (EB) cultures, are labor-intensive and susceptible to unwanted heterogeneity during differentiation. Here, we developed a more efficient approach for generating iNK cells by employing a monolayer and feeder-free differentiation protocol, alongside optimized culture media. Methods The iNK cells were generated using a two-step in vitro monolayer feeder-free system following NK cell development. To evaluate their maturity, phenotypic analysis was performed using flow cytometry, comparing with PB-NK cells and the NK-92 cell line. Additionally, single-cell RNA sequencing was performed to examine their transcriptomic profiles. The cytotoxic activity of the iNK cells was evaluated by co-culturing with cholangiocarcinoma (CCA) and breast cancer (BCA) cell lines in both monolayer (2D) and tumor spheroid (3D) co-culture systems. Results We successfully differentiated iPSCs into mesoderm (ME), hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs), and NK cells. The resulting iNK cells exhibited typical NK cell markers such as CD45, CD56, and CD16, and expressed key functional proteins, including both activating and inhibitory receptors. Single-cell RNA sequencing confirmed that the transcriptomic profile of our iNK cells closely resembles that of PB-NK cells. Importantly, our iNK cells demonstrated strong cytotoxic abilities against various CCA and BCA cell lines, surpassing the NK-92 cell line in both monolayer cultures and tumor spheroid cultures. Conclusion This study highlights the potential of iPSCs as an effective alternative cell source for generating NK cells. Using a two-step in vitro monolayer feeder-free system, we successfully generated iNK cells that not only expressed key NK cell markers and their receptors but also displayed a transcriptomic profile closely resembling PB-NK cells. Furthermore, iNK cells exhibited cytotoxicity against CCA and BCA cell lines comparable to that of PB-NK cells. This approach could pave the way for off-the-shelf NK cell products, potentially enhancing the effectiveness of adoptive NK cell therapy.

Diabetes cell replacement therapy has the potential to be transformed by human pluripotent stem cell-derived β cells (SC-β cells). However, the precise identity of SC-β cells in relationship to primary fetal and adult β-cells remains unclear. Here, we used single-cell sequencing datasets to characterize the transcriptional identity of islets from in vitro differentiation, fetal islets, and adult islets. Our analysis revealed that SC-β cells share a core β-cell transcriptional identity with human adult and fetal β-cells, however SC-β cells possess a unique transcriptional profile characterized by the persistent expression and activation of progenitor and neural-biased gene networks. These networks are present in SC-β cells, irrespective of the derivation protocol used. Notably, fetal β-cells also exhibit this neural signature at the transcriptional level. Our findings offer insights into the transcriptional identity of SC-β cells and underscore the need for further investigation of the role of neural transcriptional networks in their development.