Resolving genomic structural variation Many human genomes have been reported using short-read technology, but it is difficult to resolve structural variants (SVs) using these data. These genomes thus lack comprehensive comparisons among individuals and populations. Ebert et al. used long-read structural variation calling across 64 human genomes representing diverse populations and developed new methods for variant discovery. This approach allowed the authors to increase the number of confirmed SVs and to describe the patterns of variation across populations. From this dataset, they identified quantitative trait loci affected by these SVs and determined how they may affect gene expression and potentially explain genome-wide association study hits. This information provides insights into patterns of normal human genetic variation and generates reference genomes that better represent the diversity of our species. Science , this issue p. eabf7117

The 1000 Genomes Project (1kGP) is the largest fully open resource of whole-genome sequencing (WGS) data consented for public distribution without access or use restrictions. The final, phase 3 release of the 1kGP included 2,504 unrelated samples from 26 populations and was based primarily on low-coverage WGS. Here, we present a high-coverage 3,202-sample WGS 1kGP resource, which now includes 602 complete trios, sequenced to a depth of 30X using Illumina. We performed single-nucleotide variant (SNV) and short insertion and deletion (INDEL) discovery and generated a comprehensive set of structural variants (SVs) by integrating multiple analytic methods through a machine learning model. We show gains in sensitivity and precision of variant calls compared to phase 3, especially among rare SNVs as well as INDELs and SVs spanning frequency spectrum. We also generated an improved reference imputation panel, making variants discovered here accessible for association studies.

Abstract Significant improvements in long-read sequencing technologies have unlocked complex genomic areas, such as centromeres, in the genome and introduced the centromere annotation problem. Currently, centromeres are annotated in a semi-manual way. Here, we propose HiCAT, a generalizable automatic centromere annotation tool, based on hierarchical tandem repeat mining and maximization of tandem repeat coverage to facilitate decoding of centromere architecture. We applied HiCAT to human CHM13-T2T and gapless Arabidopsis thaliana genomes. Our results not only were generally consistent with previous inferences but also greatly improved annotation continuity and revealed additional fine structures, demonstrating HiCAT’s performance and general applicability.

Abstract Long-read and strand-specific sequencing technologies together facilitate the de novo assembly of high-quality haplotype-resolved human genomes without parent–child trio data. We present 64 assembled haplotypes from 32 diverse human genomes. These highly contiguous haplotype assemblies (average contig N50: 26 Mbp) integrate all forms of genetic variation across even complex loci such as the major histocompatibility complex. We focus on 107,590 structural variants (SVs), of which 68% are inaccessible by short-read sequencing. We identify new SV hotspots (spanning megabases of gene-rich sequence), characterize 130 of the most active mobile element source elements, and find that 63% of all SVs arise by homology-mediated mechanisms—a twofold increase from previous studies. Our resource now enables reliable graph-based genotyping from short reads of up to 50,340 SVs, resulting in the identification of 1,525 expression quantitative trait loci (SV-eQTLs) as well as SV candidates for adaptive selection within the human population.

Abstract As the state-of-the-art sequencing technologies and computational methods enable investigation of challenging regions in the human genome, an update variant benchmark is demanded. Herein, we sequenced a Chinese Quartet, consisting of two monozygotic twin daughters and their biological parents, with multiple advanced sequencing platforms, including Illumina, BGI, PacBio, and Oxford Nanopore Technology. We phased the long reads of the monozygotic twin daughters into paternal and maternal haplotypes using the parent-child genetic map. For each haplotype, we utilized advanced long reads to generate haplotype-resolved assemblies (HRAs) with high accuracy, completeness, and continuity. Based on the ingenious quartet samples, novel computational methods, high-quality sequencing reads, and HRAs, we established a comprehensive variant benchmark, including 3,883,283 SNVs, 859,256 Indels, 9,678 large deletions, 15,324 large insertions, 40 inversions, and 31 complex structural variants shared between the monozygotic twin daughters. In particular, the preciously excluded regions, such as repeat regions and the human leukocyte antigen (HLA) region, were systematically examined. Finally, we illustrated how the sequencing depth correlated with the de novo assembly and variant detection, from which we learned that 30 × HiFi is a balance between performance and cost. In summary, this study provides high-quality haplotype-resolved assemblies and a variant benchmark for two Chinese monozygotic twin samples. The benchmark expanded the regions of the previous report and adapted to the evolving sequencing technologies and computational methods.

Abstract Background Recent advances in long-read callers and assembly methods have greatly facilitated structural variants (SV) detection via read-based and assembly-based detection strategies. However, the lack of comparison studies, especially for SVs at complex genomic regions, complicates the selection of proper detection strategy for ever-increasing demand of SV analysis. Results In this study, we compared the two most widely-used strategies with six long-read datasets of HG002 genome and benchmarked them with well curated SVs at genomic regions of different complexity. First of all, our results suggest that SVs detected by assembly-based strategy are slightly affected by assemblers on HiFi datasets, especially for its breakpoint identity. Comparably, though read-based strategy is more versatile to different sequencing settings, aligners greatly affect SV breakpoints and type. Furthermore, our comparison reveals that 70% of the assembly-based calls are also detectable by read-based strategy and it even reaches 90% for SVs at high confident regions. While 60% of the assembly-based calls that are totally missed by read-based callers is largely due to the challenges of clustering ambiguous SV signature reads. Lastly, benchmarking with SVs at complex genomic regions, our results show that assembly-based approach outperforms read-based calling with at least 20X coverage, while read-based strategy could achieve 90% recall even with 5X coverage. Conclusions Taken together, with sufficient sequencing coverage, assembly-based strategy is able to detect SVs more consistently than read-based strategy under different settings. However, read-based strategy could detect SVs at complex regions with high sensitivity and specificity but low coverage, thereby suggesting its great potential in clinical application.

ABSTRACT We developed MSIsensor-pro ( https://github.com/xjtu-omics/msisensor-pro ), an open-source single sample microsatellite instability (MSI) scoring method for research and clinical applications. MSIsensor-pro introduces a multinomial distribution model to quantify polymerase slippages for each tumor sample and a discriminative sites selection method to enable MSI detection without matched normal samples. For samples of various sequencing depths and tumor purities, MSIsensor-pro significantly outperformed the current leading methods in terms of both accuracy and computational cost.

Integration of Hepatitis B virus (HBV) into human genome disrupts genetic structures and cellular functions. Here, we conducted multiplatform long read sequencing on two cell lines and five clinical samples of HBV-infected hepatocellular carcinomas (HCC). We resolved three types of viral integration-induced complex genome rearrangements (CGR) and proposed a model of ‘multi-hits and sequential-breaks’ to depict their formation process by differentiating inserted HBV copies with HiFi long reads. We deduced that all three complex types were initialized from focal replacement and fragile virus-human junctions triggered subsequent rearrangements. We further revealed that such rearrangements caused a prevalent loss-of-heterozygosity at chr4q, accounting for 19.5% of HCC samples in ICGC cohort and contributing to immune and metabolic dysfunction. Overall, our long read based analysis reveals novel sequential rearrangement processes initiated by HBV integration, hinting its structural and functional impact on HCC.

We present haplotype-resolved reference genomes and comparative analyses of six ape species, namely: chimpanzee, bonobo, gorilla, Bornean orangutan, Sumatran orangutan, and siamang. We achieve chromosome-level contiguity with unparalleled sequence accuracy (<1 error in 500,000 base pairs), completely sequencing 215 gapless chromosomes telomere-to-telomere. We resolve challenging regions, such as the major histocompatibility complex and immunoglobulin loci, providing more in-depth evolutionary insights. Comparative analyses, including human, allow us to investigate the evolution and diversity of regions previously uncharacterized or incompletely studied without bias from mapping to the human reference. This includes newly minted gene families within lineage-specific segmental duplications, centromeric DNA, acrocentric chromosomes, and subterminal heterochromatin. This resource should serve as a definitive baseline for all future evolutionary studies of humans and our closest living ape relatives.

ABSTRACT Using five complementary short- and long-read sequencing technologies, we phased and assembled >95% of each diploid human genome in a four-generation, 28-member family (CEPH 1463) allowing us to systematically assess de novo mutations (DNMs) and recombination. From this family, we estimate an average of 192 DNMs per generation, including 75.5 de novo single-nucleotide variants (SNVs), 7.4 non-tandem repeat indels, 79.6 de novo indels or structural variants (SVs) originating from tandem repeats, 7.7 centromeric de novo SVs and SNVs, and 12.4 de novo Y chromosome events per generation. STRs and VNTRs are the most mutable with 32 loci exhibiting recurrent mutation through the generations. We accurately assemble 288 centromeres and six Y chromosomes across the generations, documenting de novo SVs, and demonstrate that the DNM rate varies by an order of magnitude depending on repeat content, length, and sequence identity. We show a strong paternal bias (75-81%) for all forms of germline DNM, yet we estimate that 17% of de novo SNVs are postzygotic in origin with no paternal bias. We place all this variation in the context of a high-resolution recombination map (∼3.5 kbp breakpoint resolution). We observe a strong maternal recombination bias (1.36 maternal:paternal ratio) with a consistent reduction in the number of crossovers with increasing paternal (r=0.85) and maternal (r=0.65) age. However, we observe no correlation between meiotic crossover locations and de novo SVs, arguing against non-allelic homologous recombination as a predominant mechanism. The use of multiple orthogonal technologies, near-telomere-to-telomere phased genome assemblies, and a multi-generation family to assess transmission has created the most comprehensive, publicly available “truth set” of all classes of genomic variants. The resource can be used to test and benchmark new algorithms and technologies to understand the most fundamental processes underlying human genetic variation.