The organization of the genome in the nucleus and the interactions of genes with their regulatory elements are key features of transcriptional control and their disruption can cause disease. Here we report a genome-wide method, genome architecture mapping (GAM), for measuring chromatin contacts and other features of three-dimensional chromatin topology on the basis of sequencing DNA from a large collection of thin nuclear sections. We apply GAM to mouse embryonic stem cells and identify enrichment for specific interactions between active genes and enhancers across very large genomic distances using a mathematical model termed SLICE (statistical inference of co-segregation). GAM also reveals an abundance of three-way contacts across the genome, especially between regions that are highly transcribed or contain super-enhancers, providing a level of insight into genome architecture that, owing to the technical limitations of current technologies, has previously remained unattainable. Furthermore, GAM highlights a role for gene-expression-specific contacts in organizing the genome in mammalian nuclei. A technique called genome architecture mapping (GAM) involves sequencing DNA from a large number of thin nuclear cryosections to develop a map of genome organization without the limitations of existing 3C-based methods. Our understanding of the three-dimensional organization of the genome in the nucleus has improved dramatically as a result of both developments in microscopy and molecular methods based on chromatin conformation capture (3C). Here, Ana Pombo and colleagues present a novel method of measuring chromatin contacts, called genome architecture mapping (GAM). GAM involves sequencing DNA from a large collection of thin nuclear cryosections and, unlike 3C methods, does not require ligation to capture contacts in an unbiased manner. It overcomes some of the limitations of 3C-based methods and reveals abundant three-way contacts across the genome.

DNA methylation plays an important role in animal development and gene regulation. In mammals, several genes encoding DNA cytosine methyltransferases have been identified. DNMT1 is constitutively expressed and is required for the maintenance of global methylation after DNA replication. In contrast, the murine Dnmt3 family genes appear to be developmentally regulated and behave like de novo DNA methyltransferases in vitro. In this study, we have cloned human DNMT3A and DNMT3B that encode full-length DNMT3A and DNMT3B proteins with 98% and 94% amino acid sequence identity to their murine homologues. The DNMT3A and DNMT3B show high homology in the carboxy terminal catalytic domain and contain a conserved cysteine-rich region, which shares homology with the X-linked ATRX gene of the SNF2/SWI family. We have mapped human DNMT3A and DNMT3B to chromosomes 2p23 and 20q11.2 respectively, and determined the DNMT3B genomic structure. We further show that DNMT3A expression is ubiquitous and can be readily detected in most adult tissues, whereas DNMT3B is expressed at very low levels in most tissues except testis, thyroid and bone marrow. Significantly, both DNMT3A and DNMT3B expression is elevated in several tumor cell lines to levels comparable to DNMT1. The cloning of the human DNMT3 genes will facilitate further biochemical and genetic studies of their functions in establishment of DNA methylation patterns, regulation of gene expression and tumorigenesis.

Abstract The cohesin complex tethers sister chromatids together from the moment they are generated in S-phase until their separation in anaphase 1,2 . This fundamental phenomenon, called sister chromatid cohesion, underpins orderly chromosome segregation. The replisome complex coordinates cohesion establishment with replication of parental DNA 3 . Cohesion can be established by cohesin complexes bound to DNA before replication 4,5 , but how replisome interaction with pre-loaded cohesin complexes results in cohesion is not known. Prevailing models suggest cohesion is established by replisome passage through the cohesin ring or by transfer of cohesin behind the replication fork by replisome components 5 . Unexpectedly, by visualising single replication forks colliding with pre-loaded cohesin complexes, we find that cohesin is pushed by the replisome to where a converging replisome is met. Whilst the converging replisomes are removed during DNA replication termination, cohesin remains on nascent DNA. We demonstrate that these cohesin molecules tether the newly replicated sister DNAs together. Our results support a new model where sister chromatid cohesion is established during DNA replication termination, providing important insight into the molecular mechanism of cohesion establishment.

Abstract Upon fertilisation, the mammalian embryo must switch from dependence on maternal transcripts to transcribing its own genome, and in mice involves the transient upregulation of MERVL transposons and MERVL-driven genes at the 2-cell stage. The mechanisms and requirement for MERVL and 2-cell (2C) gene upregulation are poorly understood. Moreover, this MERVL-driven transcriptional program must be rapidly shut off to allow 2C exit and developmental progression. Here, we report that robust ribosomal RNA (rRNA) synthesis and nucleolar maturation are essential for exit from the 2C state. 2C-like cells and 2C embryos show similar immature nucleoli with altered structure and reduced rRNA output. We reveal that nucleolar disruption via blocking Pol I activity or preventing nucleolar phase separation enhances conversion to a 2C-like state in embryonic stem cells (ESCs) by detachment of the MERVL activator Dux from the nucleolar surface. In embryos, nucleolar disruption prevents proper Dux silencing and leads to 2-4 cell arrest. Our findings reveal an intriguing link between rRNA synthesis, nucleolar maturation and gene repression during early development.

Lauric acid (LA), a saturated fatty acid with 12 carbon atoms, is widely regarded as a healthy fatty acid that plays an important role in disease resistance and improving immune physiological function. The objective of this study was to determine the effects of dietary lauric acid on the growth performance, antioxidant capacity, non-specific immunity and intestinal microbiology, and evaluate the potential of lauric acids an environmentally friendly additive in swimming crab (Portunus trituberculatus) culture. A total of 192 swimming crabs with an initial body weight of 11.68 ± 0.02 g were fed six different dietary lauric acid levels, the analytical values of lauric acid were 0.09, 0.44, 0.80, 1.00, 1.53, 2.91 mg/g, respectively. There were four replicates per treatment and 8 juvenile swimming crabs per replicate. The results indicated that final weight, percent weight gain, specific growth rate, survival and feed intake were not significantly affected by dietary lauric acid levels; however, crabs fed diets with 0.80 and 1.00 mg/g lauric acid showed the lowest feed efficiency among all treatments. Proximate composition in hepatopancreas and muscle were not significantly affected by dietary lauric acid levels. The highest activities of amylase and lipase in hepatopancreas and intestine were found at crabs fed diet with 0.80 mg/g lauric acid (P<0.05), the activity of carnitine palmityl transferase (CPT) in hepatopancreas and intestine significantly decreased with dietary lauric acid levels increasing from 0.09 to 2.91 mg/g (P<0.05). The lowest concentration of glucose and total protein and the activity of alkaline phosphatase in hemolymph were observed at crabs fed diets with 0.80 and 1.00 mg/g lauric acid among all treatments. The activity of GSH-Px in hepatopancreas significantly increased with dietary lauric acid increasing from 0.09 to 1.53 mg/g, MDA in hepatopancreas and hemolymph was not significantly influenced by dietary lauric acid levels. The highest expression of cat and gpx in hepatopancreas were exhibited in crabs fed diet with 1.00 mg/g lauric acid, however, the expression of genes related to the inflammatory signaling pathway (relish, myd88, traf6, nf-κB ) were up-regulated in the hepatopancreas with dietary lauric acid levels increasing from 0.09 to 1.00 mg/g, moreover, the expression of genes related to intestinal inflammatory, immune and antioxidant were significantly affected by dietary lauric acid levels (P<0.05). Crabs fed diet without lauric acid supplementation exhibited higher lipid drop area in hepatopancreas than those fed the other diets (P<0.05). The expression of genes related to lipid catabolism was up-regulated, however, and the expression of genes related to lipid synthesis was down-regulated in the hepatopancreas of crabs fed with 0.80 mg/g lauric acid. Lauric acid improved hepatic tubular integrity, and enhanced intestinal barrier function by increasing peritrophic membrane (PM) thickness and upregulating the expression of structural factors (per44, zo-1) and intestinal immunity-related genes. In addition, dietary 1.00 mg/g lauric acid significantly improved the microbiota composition of the intestinal, increased the abundance of Actinobacteria and Rhodobacteraceae, and decreased the abundance of Vibrio, thus maintaining the microbiota balance of the intestine. The correlation analysis showed that there was a relationship between intestinal microbiota and immune-antioxidant function. In conclusion, the dietary 1.00 mg/g lauric acid is beneficial to improve the antioxidant capacity and intestinal health of swimming crab.

The DNA double helix is unwound by the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex at the eukaryotic replication fork. While isolated CMG unwinds duplex DNA very slowly, its fork unwinding rate is stimulated by an order of magnitude by single-stranded DNA binding protein, RPA. However, the molecular mechanism by which RPA enhances CMG helicase activity remained elusive. Here, we demonstrate that engagement of CMG with parental double-stranded DNA (dsDNA) at the replication fork impairs its helicase activity, explaining the slow DNA unwinding by isolated CMG. Using single-molecule and ensemble biochemistry, we show that binding of RPA to the excluded DNA strand prevents duplex engagement by the helicase and speeds up CMG-mediated DNA unwinding. When stalled due to dsDNA interaction, DNA rezipping-induced helicase backtracking re-establishes productive helicase-fork engagement underscoring the significance of plasticity in helicase action. Together, our results elucidate the dynamics of CMG at the replication fork and reveal how other replisome components can mediate proper DNA engagement by the replicative helicase to achieve efficient fork progression.

Faithful replication of chromatin domains during cell division is fundamental to eukaryotic development. During replication, nucleosomes are disrupted ahead of the replication fork, followed by their rapid reassembly on daughter strands from the pool of recycled parental and newly synthesized histones. Here, we use single-molecule imaging and replication assays in Xenopus laevis egg extracts to determine the outcome of replication fork encounters with nucleosomes. Contrary to current models, the majority of parental histones are evicted from the DNA, with histone recycling, nucleosome sliding and replication fork stalling also occurring but at lower frequencies. The anticipated local histone transfer only becomes dominant upon depletion of free histones from extracts. Our studies provide the first direct evidence that parental histones remain in close proximity to their original locus during recycling and reveal that provision of excess histones results in impaired histone recycling, which has the potential to affect epigenetic memory.

Gene expression states influence the three-dimensional conformation of the genome through poorly understood mechanisms. Here, we investigate the conformation of the murine HoxB locus, a gene-dense genomic region containing closely spaced genes with distinct activation states in mouse embryonic stem (ES) cells. To predict possible folding scenarios, we performed computer simulations of polymer models informed with different chromatin occupancy features, which define promoter activation states or CTCF binding sites. Single cell imaging of the locus folding was performed to test model predictions. While CTCF occupancy alone fails to predict the in vivo folding at genomic length scale of 10 kb, we found that homotypic interactions between active and Polycomb-repressed promoters co-occurring in the same DNA fibre fully explain the HoxB folding patterns imaged in single cells. We identify state-dependent promoter interactions as major drivers of chromatin folding in gene-dense regions.