ABSTRACT Although costly to maintain, protein homeostasis is indispensable for normal cellular function and long-term health. In mammalian cells and tissues, daily variation in global protein synthesis has been observed, but its utility and consequences for proteome integrity are not fully understood. Using several different pulse-labelling strategies, here we gain direct insight into the relationship between protein synthesis and abundance proteome-wide. We show that protein degradation varies in-phase with protein synthesis, facilitating rhythms in turnover rather than abundance. This results in daily consolidation of proteome renewal whilst minimising changes in composition. Coupled rhythms in synthesis and turnover are especially salient to the assembly of macromolecular protein complexes, particularly the ribosome, the most abundant species of complex in the cell. Daily turnover and proteasomal degradation rhythms render cells and mice more sensitive to proteotoxic stress at specific times of day, potentially contributing to daily rhythms in the efficacy of proteasomal inhibitors against cancer. Our findings suggest that circadian rhythms function to minimise the bioenergetic cost of protein homeostasis through temporal consolidation of protein turnover.

Abstract Background Inherited mutations in the LRRK2 protein are the most common known cause of Parkinson’s, but the mechanisms by which increased kinase activity of mutant LRRK2 leads to pathological events remain to be determined. In vitro assays (heterologous cell culture, phospho-protein mass spectrometry) suggest that several Rab proteins might be directly phosphorylated by LRRK2-G2019S . Which Rabs interact with LRRK2 in dopaminergic neurons to facilitate normal and pathological physiological responses remains to be determined. An in vivo screen of Rab expression in dopaminergic neurons in young adult Drosophila demonstrated a strong genetic interaction between LRRK2- G2019S and Rab10. We now ask if Rab10 is required for LRRK2-induced physiological responses in DA neurons. Methods LRRK2 - G2019S was expressed in Drosophila dopaminergic neurons and the effects of Rab10 depletion on Proboscis Extension, vision, circadian activity pattern and courtship memory determined in aged flies. Results Rab10 loss-of-function rescued bradykinesia of the Proboscis Extension Response (PER) and visual defects of aged flies expressing LRRK2-G2019S in DA neurons. Rab10 knock-down however, did not rescue the marked sleep phenotype which results from dopaminergic expression of LRRK2 - G2019S . Courtship memory is not affected by LRRK2 expression, but is markedly improved by Rab10 depletion. Anatomically, both LRRK2-G2019S and Rab10 are seen in the cytoplasm and at the synaptic endings of dopaminergic neurons. Conclusions We conclude that, in Drosophila dopaminergic neurons, Rab10 is involved differentially in LRRK2-induced behavioral deficits. Therefore, variations in Rab expression may contribute to susceptibility of different dopaminergic nuclei to neurodegeneration seen in people with Parkinson’s. Graphical Abstract Rab10 depletion ameliorates the proboscis extension bradykinesia and loss of synaptic signalling in the retina induced by LRRK2 - G2019S expression (magenta arrows / orange crosses). Rab10 manipulation does not affect the ‘sleep’ phenotype from LRRK2 - G2019S (magenta arrow). Reduction of Rab10 facilitates conditioned courtship memory, but LRRK2 has no effect (yellow arrow). All manipulations of Rab10 and G2019S in dopaminergic neurons, shown in the outline of the brain (filled cells have high levels of Rab10). We conclude that Rab10 and LRRK2 interact in some, but not all dopaminergic neurons. This may underlie differences in the susceptibility of different human striatal dopaminergic cells to Parkinson’s and explain why different symptoms initiate particular ages.

Inherited mutations in the LRRK2 protein are the commonest known cause of Parkinson's, but the molecular link from increased kinase activity to pathological neurodegeneration remains to be determined. In vitro (biochemical and cell culture) assays led to the hypothesis that several Rab GTPases might be LRRK2 substrates. Here we show that Rab10 potently modifies LRRK2-G2019S mediated electrophysiological responses in an in vivo screen, in which each Rab was overexpressed in Drosophila dopaminergic neurons. We therefore tested the effect of Rab10 loss of function on three LRRK2-G2019S phenotypes (vision, movement and sleep) that rely on dopaminergic circuits in both flies and mammals. The knock-out of Rab10 in vivo fully rescues the reduced responses induced by dopaminergic LRRK2-G2019S in visual and motor (reaching, proboscis extension) assays, but the sleep phenotype is unaffected. We show that Rab10 is expressed in dopaminergic (tyrosine hydroxylase positive) neurons controlling vision and proboscis movement, but undetectable in those controlling sleep, indicating that anatomical and physiological patterns of Rab10 are related. Our results support the idea that LRRK2 phosphorylates separate targets in distinct neurons and confirm that one degenerative pathway starts with Rab10. Although Rab3 is another putative substrate of LRRK2, it shows no synergy with G2019S and localises to a different subset of dopaminergic neurons from Rab10. We propose that variations in Rab expression may contribute to differences in the rate of neurodegeneration seen in different dopaminergic nuclei in Parkinson's.

The nematode Caenorhabditis elegans is an unconventional model in chronobiology, reported to exhibit physiological and behavioural circadian rhythms while lacking a defined transcriptional oscillator. The extent and importance of circadian rhythms in C. elegans remain uncertain, given a probable lack of functional conservation of key circadian proteins, relatively non-robust reported rhythms and an ambiguous diel ecology. Here, we investigated the temporal coordination of gene expression in C. elegans post-development using RNA sequencing. Over a circadian time series, in which we synchronised nematodes to combined light and temperature cycles, we found clear evidence of daily oscillations in 343 genes using JTK_Cycle. However, rhythms were not well-sustained in constant conditions, with only 13 genes remaining significantly rhythmic. Reanalysis of previous transcriptomic data echoed this finding in identifying far fewer rhythmic genes in constant conditions, while also identifying a greater number of rhythmic genes overall. Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), a hierarchical clustering approach, further confirmed prevalent environmentally driven daily oscillations in the RNA-seq data. This analysis additionally revealed a novel co-expression trend in which over 1000 genes exhibited hitherto unreported 16-hour oscillations, highlighting a new facet of temporal gene expression coordination in C. elegans .

Abstract Circadian behavioural deficits, such as increased daytime naps and reduced night-time sleep, are common in Alzheimer’s disease and other tauopathies. But it has remained unclear whether these circadian abnormalities arise from tau pathology in either the master pacemaker or downstream neurons. Here we study this question by selectively expressing different human tau proteins in specific Drosophila brain circuits and monitoring locomotor activity under light-dark (LD) and in “free-running” dark-dark (DD) conditions. We show that expressing human tau proteins in the fly brain recapitulates faithfully several behavioural changes found in tauopathies. We identify discrete neuronal subpopulations within the clock network as the primary target of distinct circadian behavioural disturbances in different environmental conditions. Specifically, we show that the PDF-positive pacemaker neurons are the main site for night-activity gain and -sleep loss, whereas the non-PDF clock-neurons are the main site of reduced intrinsic behavioural rhythmicity. Bioluminescence measurements revealed that the molecular clock is intact despite the behavioural arrhythmia. Our results establish that dysfunction in both the central clock- and afferent clock-neurons jointly contribute to the circadian locomotor activity rhythm disruption in Drosophila expressing human tau. Significance Statement This study directly links in vivo human tau protein expression in region-specific Drosophila clock-neurons with the resulting sleep and circadian rhythm deficits to extract new knowledge of how Alzheimer’s disease and other tauopathies perturb the balance of activity and sleep. We anticipate that this novel approach will provide a useful general template for other studies of neurodegeneration in model organisms, seeking to dissect the impact of neurodegenerative disease on circadian behaviour, and further deepening our understanding of how the clock-neuron network works.