Autophagy is an essential catabolic process that promotes clearance of surplus or damaged intracellular components 1 . As a recycling process, autophagy is also important for the maintenance of cellular metabolites during periods of starvation 2 . Loss of autophagy is sufficient to cause cell death in animal models and is likely to contribute to tissue degeneration in a number of human diseases including neurodegenerative and lysosomal storage disorders 3–7 . However, it remains unclear which of the many cellular functions of autophagy primarily underlies its role in cell survival. Here we have identified a critical role of autophagy in the maintenance of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + /NADH) levels. In respiring cells, loss of autophagy caused NAD(H) depletion resulting in mitochondrial membrane depolarisation and cell death. We also found that maintenance of NAD(H) is an evolutionary conserved function of autophagy from yeast to human cells. Importantly, cell death and reduced viability of autophagy-deficient animal models can be partially reversed by supplementation with an NAD(H) precursor. Our study provides a mechanistic link between autophagy and NAD(H) metabolism and suggests that boosting NAD(H) levels may be an effective intervention strategy to prevent cell death and tissue degeneration in human diseases associated with autophagy dysfunction.

Selective degradation of damaged mitochondria by autophagy (mitophagy) is proposed to play an important role in cellular homeostasis. However, the molecular mechanisms and the requirement of mitochondrial quality control by mitophagy for cellular physiology are poorly understood. Here, we demonstrated that primary human cells maintain highly active basal mitophagy initiated by mitochondrial superoxide signaling. Mitophagy was found to be mediated by PINK1/Parkin-dependent pathway involving p62 as a selective autophagy receptor (SAR). Importantly, this pathway was suppressed upon the induction of cellular senescence and in naturally aged cells, leading to a robust shutdown of mitophagy. Inhibition of mitophagy in proliferating cells was sufficient to trigger the senescence program, while reactivation of mitophagy was necessary for the anti-senescence effects of NAD precursors or rapamycin. Furthermore, reactivation of mitophagy by a p62-targeting small molecule rescued markers of cellular aging, which establishes mitochondrial quality control as a promising target for anti-aging interventions.

Abstract Mitochondria shape intracellular Ca 2+ signaling through the concerted activity of Ca 2+ uptake via mitochondrial calcium uniporter, and efflux from by Na + /Ca 2+ exchangers (NCLX). Here, we describe a novel relationship between NCLX, intracellular Ca 2+ , and autophagic activity. Conditions that stimulate autophagy in vivo and in vitro, such as caloric restriction and nutrient deprivation, upregulate NCLX expression in hepatic tissue and cells. Conversely, knockdown of NCLX impairs basal and starvation-induced autophagy. Similarly, acute inhibition of NCLX activity by CGP 37157 affects bulk and endoplasmic reticulum autophagy (ER-phagy) without significant impacts on mitophagy. Mechanistically, CGP 37157 inhibited the formation of FIP200 puncta and downstream autophagosome biogenesis. Inhibition of NCLX caused decreased cytosolic Ca 2+ levels, and intracellular Ca 2+ chelation similarly suppressed autophagy. Furthermore, chelation did not exhibit an additive effect on NCLX inhibition of autophagy, demonstrating that mitochondrial Ca 2+ efflux regulates autophagy through the modulation of Ca 2+ signaling. Collectively, our results show that the mitochondrial Ca 2+ extrusion pathway through NCLX is an important regulatory node linking nutrient restriction and autophagy regulation.

Abstract Aberrant mitochondrial function has been associated with an increasingly large number of human disease states. Observations from in vivo models where mitochondrial function is altered suggest that adaptations to mitochondrial dysfunction may underpin disease pathology. We hypothesized that the severity of these maladaptations could be shaped by the plasticity of the system when mitochondrial dysfunction manifests. To investigate this, we have used inducible fly models of mitochondrial complex I (CI) dysfunction to reduce mitochondrial function at two stages of the fly lifecycle, from early development and adult eclosion. Here, we show that in early life (developmental) mitochondrial dysfunction results in severe reductions in survival and stress resistance in adulthood, while flies where mitochondrial function is perturbed from adulthood, are long-lived and stress resistant despite having up to an 75% reduction in CI activity. After excluding developmental defects as a cause, we went on to molecularly characterize these two populations of mitochondrially compromised flies, short- and long-lived. We find that our short-lived flies have unique transcriptomic and metabolomic responses which overlap significantly in discreet models of CI dysfunction. Our data demonstrate that early mitochondrial dysfunction via CI depletion elicits an adaptive response which severely reduces survival, while CI depletion from adulthood is not sufficient to reduce survival and stress resistance.

Abstract Tumours face tryptophan (Trp) depletion, but the mechanisms sustaining protein biosynthesis under Trp stress remain unclear. We report that Trp stress increases the levels of the translation repressor EIF4EBP1. Yet, at the same time, EIF4EBP1 is selectively phosphorylated by the metabolic master regulator MTORC1 kinase, preventing EIF4EBP1 from inhibiting translation. MTORC1 activity under Trp stress is unexpected because the absence of amino acids is typically linked with MTORC1 inhibition. EIF4EBP1-sensitive translation in Trp starved cells is sustained by EGFR and RAS signalling to MTORC1. Via this mechanism, Trp stress enhances the synthesis and activity of the aryl hydrocarbon receptor (AHR). This is noteworthy as Trp catabolites are known to activate AHR, and therefore Trp stress was previously considered to inhibit AHR. Trp stress-induced AHR enhances the expression of key regulators of autophagy, which sustains intracellular Trp levels and Trp-charged tRNAs for translation. Hence, Trp stress switches MTORC1 from its established inhibitory function into an enhancer of autophagy, acting through AHR. The clinical potential of this fundamental mechanism is highlighted by the activity of the mTORC1-AHR pathway and an autophagy signature in 20% of glioblastoma patients, opening up new avenues for cancer therapy.

Abstract Impairment of autophagy leads to an accumulation of misfolded proteins and damaged organelles and has been implicated in plethora of human diseases. Loss of autophagy in actively respiring cells has also been shown to trigger metabolic collapse mediated by the depletion of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) pools, resulting in cell death. Here we found that the deficit in the autophagy-NAD axis underpins the loss of viability in cell models of a neurodegenerative lysosomal storage disorder, Niemann-Pick type C1 (NPC1) disease. Defective autophagic flux in NPC1 cells resulted in mitochondrial dysfunction due to impairment of mitophagy, leading to the depletion of both the reduced and oxidised forms of NAD as identified via metabolic profiling. Consequently, exhaustion of the NAD pools triggered mitochondrial depolarisation and apoptotic cell death. Our chemical screening identified two FDA-approved drugs, celecoxib and memantine, as autophagy activators which effectively restored autophagic flux, NAD levels, and cell viability of NPC1 cells. Of biomedical relevance, either pharmacological rescue of the autophagy deficiency or NAD precursor supplementation restored NAD levels and improved the viability of NPC1 patient fibroblasts and induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cortical neurons. Together, our findings identify the autophagy-NAD axis as a mechanism of cell death and a target for therapeutic interventions in NPC1 disease, with a potential relevance to other neurodegenerative disorders.

Metachromatic leukodystrophy (MLD) is a lysosomal storage disorder typically resulting from bi-allelic loss-of-function variants in the ARSA gene which encodes the lysosomal enzyme, arylsulphatase A, leading to the accumulation of its substrate, sulphatide, and widespread demyelination. Although gene therapy is available for MLD, it is limited by high cost and a narrow window for intervention, which means the development of therapies for MLD remains a key goal. The aim of the present study was to explore disease mechanisms in MLD with a view to identifying novel targets for therapeutic intervention for patients who cannot avail of gene therapy. Post-mortem globus pallidus and dentate nucleus tissue was obtained from MLD cases (N=5; age 2-33 years old) and compared to age-, sex- and ethnicity- matched controls (N=5) and studied using discovery proteomics which demonstrated a marked inflammatory response, activation of the mTOR pathway, oxidative stress and metabolic remodelling in MLD cases. Histological analysis of inflammatory markers, including the terminal fragment of complement pathway activation, C3d, and the secreted glycoprotein YKL-40, a commonly used biomarker for inflammation, demonstrated their enrichment in MLD cases. Given that the mTOR pathway plays a key role in supressing autophagy, we next investigated autophagy and identified the accumulation of autophagosomes in MLD cases, consistent with deficient autophagy. Taken together, these findings suggest inflammation and autophagy dysfunction are key processes involved in MLD and that the mTOR pathway could be a novel therapeutic target for MLD.

Abstract Mitochondria play a pivotal role in lifespan regulation, though the underlying mechanisms remain elusive. As ageing progresses, damaged mitochondria with reduced ATP production and increased Reactive Oxygen Species (ROS) generation accumulate, yet mitochondrial depletion extends the lifespan of various animal models. Our previous research demonstrated that complex I (CI) activity during development but not adulthood is crucial for determining the lifespan of Drosophila melanogaster . Still, CI-deficient mitochondria do not generate excessive ROS, failing to recapitulate mitochondrial ageing. In this study, we focus on complex IV (CIV), whose depletion leads to the accumulation of “old-mitochondria”, i.e. producing less ATP and more ROS. We reveal that CIV’s role in longevity is more intricate than CI’s, shaping lifespan through two “windows of opportunity”. The first window, shared by CI and CIV, occurs during development. Small perturbations in CIV during development lead to the emergence of short-lived flies. These flies exhibit an adult phenotype reminiscent of mitochondrial- associated diseases, primarily characterised by their inability to store fat efficiently. Accordingly, partial complementation of CIV function using an alternative oxidase (AOX) restores molecular and physiological phenotypes. The second window emerges during fly senescence, where CIV deficiency curtails lifespan without hastening ageing—flies die earlier but not more rapidly. Notably, only the developmental phenotype is associated with TOR dysregulation and altered autophagy, emphasising that developmental dysfunction uniquely interferes with nutrient sensing and the main cellular recycling pathway. This study sheds light on the multifaceted role of mitochondrial complex IV in modulating lifespan, providing potential targets for interventions to foster healthy ageing.