Abstract Axolotl ( Ambystoma mexicanum ) is a critically endangered salamander species and a model organism for regenerative and developmental biology. Despite life-long neoteny in nature and in captive-bred colonies, metamorphosis of these animals can be experimentally induced by administering Thyroid hormones (THs). However, biological consequences of this experimental procedure, such as host microbiota response and implications for regenerative capacity, remain largely unknown. Here, we systematically compared host bacterial microbiota associated with skin, stomach, gut tissues and fecal samples based on 16S rRNA gene sequences, along with limb regenerative capacity, between neotenic and metamorphic Axolotls. Our results show that distinct bacterial communities inhabit individual organs of Axolotl and undergo substantial restructuring through metamorphosis. Drastic restructuring was observed for skin microbiota, highlighted by a major transition from Firmicutes -enriched to Proteobacteria -enriched relative abundance and precipitously decreased diversity. Remarkably, shifts in microbiota was accompanied by a steep reduction in limb regenerative capacity. Fecal microbiota of neotenic and metamorphic Axolotl shared relatively higher similarity, suggesting that diet continues to shape microbiota despite fundamental transformations in the host digestive organs. The results provide novel insights into microbiological and regenerative aspects of Axolotl metamorphosis and will establish a baseline for future in-depth studies.

Abstract Trauma, vascular events, or neurodegenerative processes can lead to axonal injury and eventual transection (axotomy). Neurons can survive axotomy, yet the underlying mechanisms are not fully understood. Excessive water entry into injured neurons poses a particular risk due to swelling and subsequent death. Using in vitro and in vivo neurotrauma model systems based on laser transection, we demonstrated that axotomy triggers actomyosin contraction coupled with calpain activity. As a consequence, neurons shrink acutely to force water out through aquaporin channels preventing swelling and bursting. Inhibiting shrinkage increased the probability of neuronal cell death by about three-fold. These studies reveal a previously unrecognized cytoprotective response mechanism to neurotrauma and offer a fresh perspective on pathophysiological processes in the nervous system. One-Sentence Summary When the axon of a neuron is cut, its soma shrinks to pump out water to avoid deadly swelling.

Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a urodele amphibian endowed with remarkable regenerative capacities manifested in scarless wound healing and full restoration of amputated limbs. Several regenerative cues of the axolotl limb were successfully unraveled due to the advent of high-throughput technologies and their employment in tackling research questions on several OMICS levels. The field of regenerative biology and medicine has therefore utilized the axolotl as a major and powerful experimental model. Studies which have previously unraveled differentially expressed (DE) genes en masse in different phases of the axolotl limb regeneration have primarily used microarrays and RNA-Seq technologies. However, as different labs are conducting such experiments, sufficient consistency may be lacking due to statistical limitations arising from limited number of sample replicates as well as possible differences in study designs. This study, therefore, aims to bridge such gaps by performing an integrative analysis of publicly available microarray and RNA-Seq data from axolotl limb samples having comparable study designs. Three biological groups were conceived for the analysis; homeostatic tissues (control group), from amputation/injury timepoint up to around 50 hours post amputation (wound healing group), and from 50 hours to 28 days post amputation/injury (regenerative group). Integrative analysis was separately carried out on the selected microarray and RNA-Seq data from axolotl limb samples using the 'merging' method. Differential expression analysis was separately implemented on the processed data from both technologies using the R/Bioconductor 'limma' package. A total of 1254 genes (adjusted P < 0.01) were found DE in regenerative samples compared to the control, out of which 351 showed magnitudes of Log Fold Changes (LogFC) > 1 and were identified as the top DE genes from data of both technologies. Downstream analyses illustrated consistent correlations of the logFCs of DE genes distributed among the biological comparisons, within and between both technologies. Gene ontology annotations demonstrated concordance with the literature on the biological process involved in the axolotl limb regeneration. Future studies may benefit from the utilized concept and approach for enhanced statistical power and robust discovery of biomarkers of regeneration.

The axolotl (Ambystoma Mexicanum) salamander, an urodele amphibian, has an exceptional regenerative capacity to fully restore an amputated limb throughout the life-long lasting neoteny. By contrast, when axolotls are experimentally induced to metamorphosis, attenuation of the limb's regenerative competence is noticeable. Here, we sought to discern the proteomic profiles of the early stages of blastema formation of neotenic and metamorphic axolotls after limb amputation by means of LC-MS/MS technology. We quantified a total of 714 proteins having an adjusted p < 0.01 with FC greater or equal to 2 between two conditions. Principal component analysis revealed a conspicuous clustering between neotenic and metamorphic samples at 7 days post-amputation. Different set of proteins was identified as differentially expressed at all of the time points (1, 4, and 7 days post-amputations against day0) for neotenic and metamorphic stages. Although functional enrichment analyses underline the presence of common pathways between regenerative and non-regenerative stages, cell proliferation and its regulation associated pathways, immune system related pathways and muscle tissue and ECM remodeling and degradation pathways were represented at different rate between both stages. To validate the proteomics results and provide evidence for the putative link between immune system activity and regenerative potential, qRT-PCR for selected genes was performed. Raw data used in this study is available via ProteomeXchange with identifier XXYY.

In this study, we introduce a new separation of phases-based activity reporter of kinase (SPARK) for AMP-activated kinase (AMPK), named AMPK-SPARK, which reports the AMPK activation by forming bright fluorescent clusters. Furthermore, we introduce a dual reporter system, named GCaMP-AMPK-SPARK, by incorporating a single-fluorescent protein (FP)-based Ca2+ biosensor, GCaMP6f, into our initial design, enabling simultaneous monitoring of Ca2+ levels and AMPK activity. This system offers the essential quality of information by single-channel fluorescence microscopy without the need for coexpression of different biosensors and elaborate filter layouts to overcome spectral limitations. We used AMPK-SPARK to map endogenous AMPK activity in different cell types and visualized the dynamics of AMPK activation in response to various stimuli. Using GCaMP-AMPK-SPARK, we revealed cell-to-cell heterogeneities in AMPK activation by Ca2+ mobilization. We anticipate that this dual reporter strategy can be employed to study the intricate interplays between different signaling networks and kinase activities.

Abstract The relationship between hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and nitric oxide (NO) in the vasculature is multifaceted and remains controversial because the dynamic detection of these reactive molecules is challenging. Genetically encoded biosensors (GEBs) allow visualizing real-time dynamics in living cells and permit multiparametric detection of several analytes. Although robust, GEBs’ utility depends on several parameters that need fine-tuning for proper imaging and correct data analysis: i.e., camera binning, temperature, and the resolution power of the imaging instruments are some critical parameters that require optimization. We have generated a new double-stable transgenic endothelial cell line stably expressing the biosensors HyPer7 and O-geNOp and systematically tested different imaging modes and their impact on the performance of each biosensor. Ambient temperature and the type of imaging mode did not influence the results, while camera resolution settings significantly affected readouts of HyPer probes but not O-geNOp. Changing a single parameter in a co-imaging mode significantly altered the biosensor’s dynamic measurements, potentially causing misinterpretation. This study provides a general guide and the pitfalls of employing GEBs in a multispectral imaging mode.

Regenerative biology is a pivotal field aimed at understanding and harnessing the ability of organisms to restore damaged tissues and organs. The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a key model organism renowned for its exceptional regenerative capabilities, particularly in limb regeneration. However, current in vitro research is hampered by the lack of well-defined axolotl blastema cell lines and unreliable primary culture protocols. To address these challenges, we present a novel, robust, gel-free 3D culture system for axolotl blastema cells. This system overcomes limitations of 2D culture methods by enabling the formation of spheroid structures that closely mimic the in vivo environment. Using this protocol, we observed that spheroids derived from axolotl blastema tissues retained key regenerative markers, including PRRX1, and exhibited stable expression of crucial blastema markers through extended culture periods. Our approach facilitates the study of cellular and molecular mechanisms underlying limb regeneration in axolotls and provides a valuable tool for drug testing and regenerative research. The development of this 3D culture system represents a significant advancement in regenerative biology, offering a more consistent and reliable model for exploring the regenerative potential of axolotl cells.

Abstract The Hippo pathway plays an imperative role in cellular processes such as differentiation, regeneration, cell migration, organ growth, apoptosis, and cell cycle. Transcription coregulator component of Hippo pathway, YAP1, promotes transcription of genes involved in cell proliferation, migration, differentiation, and suppressing apoptosis. However, its role in epimorphic regeneration has not been fully explored. The axolotl is a well-established model organism for developmental biology and regeneration studies. By exploiting its remarkable regenerative capacity, we investigated the role of Yap1 in the early blastema stage of limb regeneration. Depleting Yap1 using gene-specific morpholinos attenuated the competence of axolotl limb regeneration evident in bone formation defects. To explore the affected downstream pathways from Yap1 down-regulation, the gene expression profile was examined by employing LC-MS/MS technology. Based on the generated data, we provided a new layer of evidence on the putative roles of increased protease inhibition and immune system activities and altered ECM composition in diminished bone formation capacity during axolotl limb regeneration upon Yap1 deficiency. We believe that new insights into the roles of the Hippo pathway in complex structure regeneration were granted in this study.

SUMMARY Deregulation of glycolysis is common in non-small cell lung cancer (NSCLC). Hexokinase (HK) enzymes catalyze the phosphoryl-group-transfer in glucose metabolism. There are a very few studies that have begun to reveal the connections between glucose metabolism and splicing programs. Unlike HK2 gene, which is expressed as a single transcript, there are several transcripts of the HK1 gene due to alternative splicing. However, the functional differential roles of HK1 isoforms in glucose metabolism and tumor progression are still elusive. Here, we show that primary NSCLC patient tumor cells metabolically differ from the normal lung epithelium where they display predominant expression of one of the HK1 transcripts, hexokinase1b (HK1b). We utilized CRISPR-Cas9 system to selectively target specific HK1b isoform in NSCLC and show that silencing HK1b in NSCLC cells inhibits tumorigenesis through diminishing glycolysis and proliferation. Our findings constitute the first demonstration of the first biochemical distinction between the HK1 splice variants. Finally, HK1b deletion sensitizes NSCLC cells to standard-of-care, cisplatin treatment, and the combination therapy synergistically increases both apoptotic cell death by cisplatin and autophagic cell death by increased formation of LC3-II associated autophagic vesicles and myelinoid bodies. Notably, loss of HK1b leads to cellular DNA damage, further combination with cisplatin therapy showed significantly increased levels of DNA damage. Importantly, we showed that glycolysis and cisplatin resistance can be restored by adding-back HK1b in HK1b knock-out cells. Our findings reveal that targeting HK1b isoform alone or in combination with cisplatin may represent a novel strategy for NSCLC patients.

Abstract Huntington’s disease is a neurodegenerative disease caused by expansion of CAG repeats in exon-1 of Huntingtin (HTT) gene leading to production of mutant Huntingtin (mHtt) protein. Htt protein is known to play crucial roles in regulation of cytoskeletal dynamics and vesicular transport in physiological conditions. By combining in vitro time-lapse imaging and correlative light and electron microscopy (CLEM), we investigated the subcellular dynamics of mHtt during the process aggregate formation. Here we show that distribution of F-actin is affected by mHtt aggregation. F-actin tends to relocate from the peripheral to perinuclear area in cells with mHtt aggregates, possibly caused by sequestration of F-actin from cell membrane to aggregation zones. In accordance with this, mHtt in hippocampal neurons were aggregated into axonal varicosities together with F-actin as they have higher F-actin expression in their neurites compared to their soma. Additionally, correlative light and electron microscopy (CLEM) revealed increased mitochondrial accumulation at the periphery of mHtt aggregates which is surrounded by a F-actin mesh. Mitochondria targeted HyPerRed, a genetically encoded hydrogen peroxide sensor, revealed that oxidative stress in mHtt expressing cells increased. Thus, our findings give new insights about the pathology caused by mHtt through interplay of aggregates with F-actin cytoskeleton and mitochondrial oxidative stress.