Abstract 3D bioengineered skeletal muscle macrotissues are increasingly important for studies of cell biology and development of therapeutics. Tissues derived from immortalized cells obtained from patient samples or from stem cells can be co-cultured with motor-neurons to create models of human neuromuscular junctions in culture. In this study, we present foundational work on 3D cultured muscle ultrastructure, with and without motor neurons, which is enabled by the development of a new co-culture platform. Our results show that tissues from Duchenne muscular dystrophy patients are poorly organized compared to tissues grown from healthy donor and that the presence of motor neurons invariably improves sarcomere organization. Electron micrographs show that in the presence of motor neurons, filament directionality, banding patterns, z-disc continuity and appearance of presumptive SSR and T-tubule profiles all improve in healthy, DMD and iPSC derived muscle tissue. Further work to identify the underlying defects of DMD tissue disorganization and the trophic mechanisms by which motor neurons support muscle are likely to yield potential new therapeutic approaches for treating patients suffering from Duchenne muscular dystrophy.

Two-dimensional (2D) human skeletal muscle fiber cultures are ill equipped to support the contractile properties of maturing muscle fibers. This limits their application to the study of adult human neuromuscular junction (NMJ) development, a process requiring maturation of muscle fibers in the presence of motor neuron endplates. Here we describe a three-dimensional (3D) co-culture method whereby human muscle progenitors mixed with human pluripotent stem cell-derived motor neurons self-organize to form functional NMJ connections within two weeks. Functional connectivity between motor neuron endplates and muscle fibers is confirmed with calcium transient imaging and electrophysiological recordings. Notably, we only observed epsilon acetylcholine receptor subunit protein upregulation and activity in 3D co-culture. This demonstrates that the 3D co-culture system supports a developmental shift from the embryonic to adult form of the receptor that does not occur in 2D co-culture. Further, 3D co-culture treatments with myasthenia gravis patient sera shows the ease of studying human disease with the system. This work delivers a simple, reproducible, and adaptable method to model and evaluate adult human NMJ de novo development and disease in culture.

Abstract Recently, methods for creating three-dimensional (3D) human skeletal muscle tissues from myogenic cell lines have been reported. Bioengineered muscle tissues are contractile and respond to electrical and chemical stimulation. In this study we provide an electrophysiological analysis of healthy and dystrophic 3D bioengineered skeletal muscle tissues. We focus on Duchenne muscular dystrophy (DMD), a fatal muscle disorder involving the skeletal muscle system. The dystrophin gene, which when mutated causes DMD, encodes for the Dystrophin protein, which anchors the cytoskeletal network inside of a muscle cell to the extracellular matrix outside the cell. Here, we enlist a 3D in vitro model of DMD muscle tissue, to evaluate an understudied aspect of DMD, muscle cell electrical properties uncoupled from presynaptic neural inputs. Our data shows that electrophysiological aspects of DMD are replicated in the 3D bioengineered skeletal muscle tissue model. Furthermore, we test a block co-polymer, poloxamer 188, and demonstrate capacity for improving the membrane potential in DMD muscle.Therefore, this study serves as the baseline for a new in vitro method to examine potential therapies directed at muscular disorders.

Executive function deficits in Alzheimer's disease (AD) occur early in disease progression and may be predictive of cognitive decline. Accordingly, these deficits are of great clinical interest for the development of early interventions. Few preclinical studies have evaluated executive functions, and of those, the majority rely on aversive paradigms to assess cognition. This is discordant with the way AD patients are tested in the clinic. To address this, we aimed to use touchscreens to assess whether APP/PS1 mice show analogous impairments on similar executive function tasks to AD patients. Mice were assessed between 12 and 26 months of age on two tasks assessing executive function, namely the pairwise discrimination and reversal task and/or extinction. No differences in pairwise discrimination or reversal learning were seen in 12-13 month old APP/PS1 animals. When mice were assessed later in disease progression at 24 months of age, APP/PS1 mice were impaired in the reversal component of the task but not initial pairwise discrimination compared to WT mice. Extinction learning was assessed in 13, 16 and 26-month-old animals and APP/PS1 mice showed an attenuation of rate of extinction at 16 months of age. Given the age of the mice, we sought to confirm that impairments in the reversal task were unrelated to previously reported visual impairments in both AD mouse models and humans. Electroretinography and optical coherence tomography assays were used to assess functional and structural retinal health at time-points coinciding with subtle and severe impairments. Touchscreen tested and behaviourally naive animals showed no markers of retinal degradation, indicating the deficits seen in APP/PS1 mice are directly related to cognition. This is the first characterisation of executive function in APP/PS1 mice utilising clinical modes of assessment and has great potential to facilitate translation from preclinical models to the clinic.