ABSTRACT EGFR-TKIs achieved excellent efficacy in EGFR-mutated patients. Unfortunately, most patients would inevitably develop progressive disease within a median of 10 to 14 months. Predicting the resistance probability remains a challenge. Therefore, we created an R-index model trained by single-cell RNA data with the OCLR algorithm. This model can be applied to estimate the level of EGFR-TKI resistance in cell line and xenograft mice models and predict prognosis in multiple cohorts. Comparing the high and the low R-index group, we found that the glycolysis pathway and KRAS up-regulation pathway were related to resistance, and MDSC was the leading cause of immunosuppression in the tumor microenvironment. These results are consistent with previous studies indicating that the R-index provides an insight into resistance status and a new way to explore resistance mechanisms and clinical treatment by the combination of Glucose metabolism-targeted or MDSC-targeted therapies. This is the first quantification method of EGFR-TKI resistance based on single-cell sequencing data solving the problem of the mixed resistance state of tumor cells and helping explore transcriptome characteristics of drug-resistant cell populations.

Abstract High-throughput UMI technology sequencing is widely used in early tumor screening, detection, recurrence monitoring, etc. Detecting extremely low-frequency mutations is especially important for monitoring tumor recurrence, so high-precision data, as well as high-quality data, are required. We developed RealSeq2 , a new integrated data-preprocessing software based on fastp and gencore, to achieve adapter removal, quality control, UMI identification, and generate consensus reads by clustering and error correction using multithreading in high-throughput next-generation sequencing background. RealSeq2 also supports methylation data of 5-methylcytosine bisulfite-free sequencing. RealSeq2 defined a new tag in SAM for storing methylation information, which is beneficial for co-identifying methylation sites and mutation sites for downstream analysis. RealSeq2 includes three submodules: ReadsProfiler, ReadsCleaner, and ReadsRecycler. In addition, the output format file (BAM or SAM) is universal for downstream analyses. RealSeq2 is the preferred upstream analysis software for the co-detection of ultra-low frequency mutations and bisulfite-free methylation data. The error profile provides data support for downstream analysis. Additionally, XM tags will become a standard protocol for recording methylation signals.