ABSTRACT The tissue microenvironment in prostate cancer is profoundly altered. While such alterations have been implicated in driving prostate cancer initiation and progression to aggressive disease, how prostate cancer cells and their precursors mediate those changes is unclear, in part due to the inability to longitudinally study the disease evolution in human tissues. To overcome this limitation, we performed extensive single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) and rigorous molecular pathology of the comparative biology between human prostate cancer and key time points in the disease evolution of a genetically engineered mouse model (GEMM) of prostate cancer. Our studies of human tissues, with validation in a large external data set, revealed that cancer cell-intrinsic activation of MYC signaling was the top up-regulated pathway in human cancers, representing a common denominator across the well-known molecular and pathological heterogeneity of human prostate cancer. Likewise, numerous non-malignant cell states in the tumor microenvironment (TME), including non-cancerous epithelial, immune, and fibroblast cell compartments, were conserved across individuals, raising the possibility that these cell types may be a sequelae of the convergent MYC activation in the cancer cells. To test this hypothesis, we employed a GEMM of prostate epithelial cell-specific MYC activation in two mouse strains. Cell communication network and pathway analyses suggested that MYC oncogene-expressing neoplastic cells, directly and indirectly, reprogrammed the TME during carcinogenesis, leading to the emergence of cascading cell state alterations in neighboring epithelial, immune, and fibroblast cell types that paralleled key findings in human prostate cancer. Importantly, among these changes, the progression from a precursor-enriched to invasive-cancer-enriched state was accompanied by a cell-intrinsic switch from pro-immunogenic to immunosuppressive transcriptional programs with coinciding enrichment of immunosuppressive myeloid and Treg cells in the immune microenvironment. These findings implicate activation of MYC signaling in reshaping convergent aspects of the TME of prostate cancer as a common denominator across the otherwise well-documented molecular heterogeneity of human prostate cancer.

How prostate cancer cells and their precursors mediate changes in the tumor microenvironment (TME) to drive prostate cancer progression is unclear, in part due to the inability to longitudinally study the disease evolution in human tissues. To overcome this limitation, we perform extensive single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) and molecular pathology of the comparative biology between human prostate cancer and key stages in the disease evolution of a genetically engineered mouse model (GEMM) of prostate cancer. Our studies of human tissues reveal that cancer cell-intrinsic activation of MYC signaling is a common denominator across the well-known molecular and pathological heterogeneity of human prostate cancer. Cell communication network and pathway analyses in GEMMs show that MYC oncogene-expressing neoplastic cells, directly and indirectly, reprogram the TME during carcinogenesis, leading to a convergence of cell state alterations in neighboring epithelial, immune, and fibroblast cell types that parallel key findings in human prostate cancer.

In cancers, maintenance of telomeres often occurs through activation of the catalytic subunit of telomerase, encoded by TERT. Yet, most cancers show only modest levels of telomerase gene expression, even in the context of activating hotspot promoter mutations (C228T and C250T). The role of epigenetic mechanisms, including DNA methylation, in regulating telomerase gene expression in cancer cells is not fully understood. Here, we have carried out the most comprehensive characterization to date of TERT promoter methylation using ultra-deep bisulfite sequencing spanning the CpG island surrounding the core TERT promoter in 96 different human cell lines. In general, we observed that immortalized and cancer cell lines were hypermethylated in a region upstream of the recurrent C228T and C250T TERT promoter mutations, while non-malignant primary cells were comparatively hypomethylated in this region. However, at the allele-level, we generally observe hypermethylation of promoter sequences in cancer cells is associated with repressed expression, and the remaining unmethylated alleles marked with open chromatin are largely responsible for the observed TERT expression in cancer cells. Our findings suggest that hypermethylation of the TERT promoter alleles signals transcriptional repression of those alleles, leading to the attenuation of TERT activation in cancer cells.

Abstract Acquiring a telomere maintenance mechanism is one of the hallmarks of high-risk neuroblastoma and commonly occurs by expressing telomerase ( TERT ). Telomerase-negative neuroblastoma has, characteristically, long telomeres and most utilize the telomerase-independent alternative lengthening of telomeres (ALT) mechanism. Conversely, no discernable telomere maintenance mechanism is detected in a fraction of neuroblastoma with long telomeres, representing a phenomenon referred to as ever-shorter telomeres. Here, we show that, unlike most cancers, DNA of the TERT promoter is broadly hypomethylated in neuroblastoma. In telomerase-positive neuroblastoma cells, the hypomethylated DNA promoter is approximately 1.5-kb in length and is bound by hypermethylated TERT gene body and upstream intergenic sequences. The TERT locus shows active chromatin marks including H3K4me3, H3K27Ac, H3K14Ac, RNA PolII and BRD4 with low enrichment for the repressive mark, H3K27me3. Strikingly, in neuroblastoma with long telomeres, the hypomethylated region spans the entire TERT locus, including multiple nearby genes with enrichment for the repressive H3K27me3 chromatin mark. Furthermore, subtelomeric regions showed enrichment of repressive chromatin marks in neuroblastomas with long telomeres relative to those with short telomeres. These repressive marks were even more evident at the genic loci, suggesting a telomere position effect. Inhibiting H3K27 methylation by the EZH2 inhibitor, Tazemetostat, induced the expression of TERT , particularly in cell lines with long telomeres and H3K27me3 marks in the promoter region. Taken together, these data suggest that epigenetic regulation of TERT expression differs in neuroblastoma depending on the telomere maintenance status, and H3K27 methylation is important in repressing TERT expression in neuroblastoma with long telomeres.

Acquiring a telomere maintenance mechanism is a hallmark of high-risk neuroblastoma and commonly occurs by expressing telomerase (TERT). Telomerase-negative neuroblastoma has long telomeres and utilizes the telomerase-independent alternative lengthening of telomeres (ALT) mechanism. Conversely, no discernable telomere maintenance mechanism is detected in a fraction of neuroblastoma with long telomeres. Here, we show, unlike most cancers, DNA of the TERT promoter is broadly hypomethylated in neuroblastoma. In telomerase-positive neuroblastoma cells, the hypomethylated DNA promoter is approximately 1.5 kb. The TERT locus shows active chromatin marks with low enrichment for the repressive mark, H3K27me3. MYCN, a commonly amplified oncogene in neuroblstoma, binds to the promoter and induces TERT expression. Strikingly, in neuroblastoma with long telomeres, the hypomethylated region spans the entire TERT locus, including multiple nearby genes with enrichment for the repressive H3K27me3 chromatin mark. Furthermore, subtelomeric regions showed enrichment of repressive chromatin marks in neuroblastomas with long telomeres relative to those with short telomeres. These repressive marks were even more evident at the genic loci, suggesting a telomere position effect (TPE). Inhibiting H3K27 methylation by three different EZH2 inhibitors induced the expression of TERT in cell lines with long telomeres and H3K27me3 marks in the promoter region. EZH2 inhibition facilitated MYCN binding to the TERT promoter in neuroblastoma cells with long telomeres. Taken together, these data suggest that epigenetic regulation of TERT expression differs in neuroblastoma depending on the telomere maintenance status, and H3K27 methylation is important in repressing TERT expression in neuroblastoma with long telomeres.