Abstract In filamentous fungi, gene silencing by RNA interference (RNAi) shapes many biological processes, including pathogenicity. Recently, fungal small RNAs (sRNAs) have been shown to act as effectors that disrupt gene activity in interacting plant hosts, thereby undermining their defence responses. We show here that the devastating mycotoxin-producing ascomycete Fusarium graminearum ( Fg ) utilizes DICER-like (DCL)-dependent sRNAs to target defence genes in two Poaceae hosts, barley ( Hordeum vulgare Hv ) and Brachypodium distachyon ( Bd ). We identified 104 Fg -sRNAs with sequence homology to host genes that were repressed during interactions of Fg and Hv , while they accumulated in plants infected by the DCL double knock-out (dKO) mutant PH1- dcl1/2 . The strength of target gene expression correlated with the abundance of the corresponding Fg -sRNA. Specifically, the abundance of three tRNA-derived fragments (tRFs) targeting immunity-related Ethylene overproducer 1-like 1 ( HvEOL1) and three Poaceae orthologues of Arabidopsis thaliana BRI1-associated receptor kinase 1 ( HvBAK1, HvSERK2 and BdSERK2 ) was dependent on fungal DCL. Additionally, RNA-ligase-mediated Rapid Amplification of cDNA Ends (RLM-RACE) identified infection-specific degradation products for the three barley gene transcripts, consistent with the possibility that tRFs contribute to fungal virulence via targeted gene silencing. Significance Statement Fusarium graminearum is one of the most devastating fungal pathogens in cereals, while understanding the mechanisms of fungal pathogenesis is a prerequisite for developing efficient and environmentally friendly crop protection strategies. We show exploratory data suggesting that fungal small RNAs play a critical role in Fusarium virulence by suppressing plant immunity.

Abstract Circular RNAs (circRNAs) are single-stranded molecules that have attracted increasing attention in recent years due to their covalently closed structure and their diverse functional roles in mammalian cells, where they are involved in the regulation of gene expression and protein function. Increasing evidence suggests that circRNAs have similar functions in plants, where they play a role in plant development, resistance to biotic stress, and abiotic stress tolerance. Here, we investigated the agronomically relevant question of whether synthetic designer circRNAs can be used to modulate in a sequence-specific manner gene expression in plants. We show that treatment of GFP -expressing Arabidopsis protoplasts with designer 50 nt GFP antisense circRNA (circRNA GFP ) reduces the cellular accumulation of the reporter protein in a sequence-specific and dose-dependent manner. This inhibitory activity of circRNA GFP was not abolished in various Arabidopsis ago and dcl mutants with defective RNAi pathways. Moreover, and in contrast to other types of RNA such as double-stranded (ds)RNA, circRNAs did not induce a PTI response in plant leaves. We discuss the possibility that circRNA may be applied to regulate endogenous plant genes and thus may have future potential as a novel bioherbicide.

Microbial pathogens secrete small RNA (sRNA) effectors into plant hosts to aid infection by silencing transcripts of immunity and signaling-related genes through RNA interference (RNAi). Similarly, sRNAs from plant hosts have been shown to contribute to plant defense against microbial pathogens by targeting transcripts involved in virulence. This phenomenon is called bidirectional RNA communication or cross kingdom RNAi (ckRNAi). How far this RNAi-mediated mechanism is evolutionarily conserved is the subject of controversial discussions. We examined the bidirectional accumulation of sRNAs in the interaction of the hemibiotrophic rice blast fungus Magnaporthe oryzae ( Mo ) with the grass model plant Brachypodium distachyon ( Bd ). By comparative deep sequencing of sRNAs and mRNAs from axenic fungal cultures and infected leaves and roots, we found a wide range of fungal sRNAs that accumulated exclusively in infected tissues. Amongst those, 20-21 nt candidate sRNA effectors were predicted in silico by selecting those Mo reads that had complementary mRNA targets in Bd . Many of those mRNAs predicted to be targeted by Mo sRNAs were differentially expressed, particularly in the necrotrophic infection phase, including gene transcripts involved in plant defense responses and signaling. Vice versa, by applying the same strategy to identify Bd sRNA effectors, we found that Bd produced sRNAs targeting a variety of fungal transcripts, encoding fungal cell wall components, virulence genes and transcription factors. Consistent with function as effectors of these Bd sRNAs, their predicted fungal targets were significantly down-regulated in the infected tissues compared to axenic cultures, and deletion mutants for some of these target genes showed heavily impaired virulence phenotypes. Overall, this study provides the first experimentally-based evidence for bidirectional ckRNAi in a grass-fungal pathosystem, paving the way for further validation of identified sRNA-target duplexes and contributing to the emerging research on naturally occurring cross-kingdom communication and its implications for agriculture on staple crops.Author Summary In the present work, we provide first experimental evidence for bidirectional RNA communication in a grass-fungal pathosystem. We deployed the monocotyledonous plant Brachypodium distachyon , which is a genetic model for the staple crops wheat and rice, to investigate the interaction-related sRNAs for their role in RNA communication. By applying a previously published bioinformatics pipeline for the detection of sRNA effectors we identified potential plant targets for fungal sRNAs and vice versa, fungal targets for plant sRNAs. Inspection of the respective targets confirmed their downregulation in infected relative to uninfected tissues and fungal axenic cultures, respectively. By focusing on potential fungal targets, we identified several genes encoding fungal cell wall components, virulence proteins and transcription factors. The deletion of those fungal targets has already been shown to produce disordered virulence phenotypes. Our findings establish the basis for further validation of identified sRNA-mRNA target duplexes and contribute to the emerging research on naturally occurring cross-kingdom communication and its implications for agriculture.

Abstract Bidirectional communication between pathogenic microbes and their plant hosts via small (s)RNA-mediated cross-kingdom RNA interference (ckRNAi) is one key element for successful host colonisation. However, whether mutualistic fungi from the Serendipitaceae family, known for their extremely broad host range, employ sRNAs to colonize plant roots is still under discussion. To address this question, we developed a pipeline to validate the accumulation, translocation, and activity of fungal sRNAs in post-transcriptional silencing of Arabidopsis thaliana genes. Using stem-loop PCR, we detected the expression of a specific set of Serendipita indica ( Si) sRNAs, targeting host genes involved in cell wall organization, hormonal signalling regulation, immunity, and gene regulation. To confirm the gene silencing activity of these sRNA in plant cells, Si sRNAs were transiently expressed in protoplasts. Stem-loop PCR proved the expression of sRNAs, while qPCR validated post-transcriptional gene silencing of their predicted target genes. Furthermore, ARGONAUTE 1 immunoprecipitation ( At AGO1-IP) revealed the loading of fungal Si sRNAs into the plant RNAi machinery, suggesting the translocation of Si sRNA from the fungus into root cells. In conclusion, this study provides a blueprint for rapid selection and analysis of sRNA effectors in plant-microbe interactions and further suggests cross-kingdom communication in the Sebacinoid symbiosis. Highlight Small RNAs of the beneficial fungus Serendipita indica are translocated and silence Arabidopsis genes at the onset of the interaction, revealing cross-kingdom communication in sebacinoid symbiosis.

RNA interference (RNAi) is a crucial mechanism that can contribute to immunity against infectious microbes through the action of DICER-LIKE (DCL) and ARGONAUTE (AGO) proteins. In the case of the fungal pathogen Botrytis cinerea and the oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis , plant DCL and AGO proteins have proven roles as negative regulators of immunity, suggesting functional specialization of these proteins. To address this aspect in a broader taxonomic context, we characterized the colonization pattern of an informative set of DCL and AGO loss-of-function mutants in Arabidopsis thaliana upon infection with a panel of pathogenic microbes with different lifestyles, and a fungal mutualist. Our results revealed that AGO1 and AGO4 function as positive regulators of immunity to a bacterial and a fungal pathogen, respectively. Additionally, AGO2 and AGO10 positively modulated the colonization by a fungal mutualist. Therefore, analysing the role of RNAi across a broader range of plant-microbe interactions has identified previously unknown functions for AGO proteins. For some pathogen interactions, however, all tested mutants exhibited wild type-like infection phenotypes, suggesting that the roles of AGO and DCL proteins in these interactions may be more complex to elucidate.