Marco Marra and colleagues identify somatic mutations in EZH2 in diffuse large B-cell lymphomas and follicular lymphomas. EZH2 is a histone methyltransferase that participates in trimethylation of H3 Lys27 (H3K27) as part of the PRC2 complex. The mutations alter a single tyrosine residue in the SET domain of EZH2 and reduce the ability of PRC2 to trimethylate H3K27 in vitro. Follicular lymphoma (FL) and the GCB subtype of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) derive from germinal center B cells1. Targeted resequencing studies have revealed mutations in various genes encoding proteins in the NF-κB pathway2,3 that contribute to the activated B-cell (ABC) DLBCL subtype, but thus far few GCB-specific mutations have been identified4. Here we report recurrent somatic mutations affecting the polycomb-group oncogene5 EZH2, which encodes a histone methyltransferase responsible for trimethylating Lys27 of histone H3 (H3K27). After the recent discovery of mutations in KDM6A (UTX), which encodes the histone H3K27me3 demethylase UTX, in several cancer types6, EZH2 is the second histone methyltransferase gene found to be mutated in cancer. These mutations, which result in the replacement of a single tyrosine in the SET domain of the EZH2 protein (Tyr641), occur in 21.7% of GCB DLBCLs and 7.2% of FLs and are absent from ABC DLBCLs. Our data are consistent with the notion that EZH2 proteins with mutant Tyr641 have reduced enzymatic activity in vitro.

Follicular lymphoma (FL) and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) are the two most common non-Hodgkin lymphomas (NHLs). Here we sequenced tumour and matched normal DNA from 13 DLBCL cases and one FL case to identify genes with mutations in B-cell NHL. We analysed RNA-seq data from these and another 113 NHLs to identify genes with candidate mutations, and then re-sequenced tumour and matched normal DNA from these cases to confirm 109 genes with multiple somatic mutations. Genes with roles in histone modification were frequent targets of somatic mutation. For example, 32% of DLBCL and 89% of FL cases had somatic mutations in MLL2, which encodes a histone methyltransferase, and 11.4% and 13.4% of DLBCL and FL cases, respectively, had mutations in MEF2B, a calcium-regulated gene that cooperates with CREBBP and EP300 in acetylating histones. Our analysis suggests a previously unappreciated disruption of chromatin biology in lymphomagenesis. Despite being a focus of research activity for many years, the mutations driving the two most common non-Hodgkin lymphomas — follicular lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma — have remained cryptic. Whole genome sequencing, combined with transcriptome analysis and further resequencing of candidate genes in additional tumours, now show that histone methyltransferases and acetylases are frequently affected by mutations in these tumours. This study suggests a previously unappreciated importance of chromatin biology in lymphomagenesis.

Next-generation sequencing approaches have been used to investigate the genomes and transcriptomes of an oestrogen-receptor-α-positive metastatic lobular breast cancer from a patient — rather than from a cell line or xenograft — over a 9-year period between the diagnosis of the primary tumour and the appearance of metastasis. Comparison of the somatic non-synonymous coding mutations in the metastasis and the primary tumour of the same patient and the combined analysis of genome and transcriptome data provided insights into the mutational evolution that can occur with disease progression. The cover shows sequence elements of the HAUS3 locus, one of the genes found to be mutated in the tissue (shown in the background) from the primary lobular cancer used for this work. Advances in next generation sequencing have made it possible to precisely characterize the coding mutations that occur during the development and progression of individual cancers. Here, this technique is used to sequence the genomes and transcriptomes of an oestrogen-receptor-α-positive metastatic lobular breast cancer; significant evolution is found to occur with disease progression. Recent advances in next generation sequencing1,2,3,4 have made it possible to precisely characterize all somatic coding mutations that occur during the development and progression of individual cancers. Here we used these approaches to sequence the genomes (>43-fold coverage) and transcriptomes of an oestrogen-receptor-α-positive metastatic lobular breast cancer at depth. We found 32 somatic non-synonymous coding mutations present in the metastasis, and measured the frequency of these somatic mutations in DNA from the primary tumour of the same patient, which arose 9 years earlier. Five of the 32 mutations (in ABCB11, HAUS3, SLC24A4, SNX4 and PALB2) were prevalent in the DNA of the primary tumour removed at diagnosis 9 years earlier, six (in KIF1C, USP28, MYH8, MORC1, KIAA1468 and RNASEH2A) were present at lower frequencies (1–13%), 19 were not detected in the primary tumour, and two were undetermined. The combined analysis of genome and transcriptome data revealed two new RNA-editing events that recode the amino acid sequence of SRP9 and COG3. Taken together, our data show that single nucleotide mutational heterogeneity can be a property of low or intermediate grade primary breast cancers and that significant evolution can occur with disease progression.

MicroRNAs (miRNAs) are emerging as important, albeit poorly characterized, regulators of biological processes. Key to further elucidation of their roles is the generation of more complete lists of their numbers and expression changes in different cell states. Here, we report a new method for surveying the expression of small RNAs, including microRNAs, using Illumina sequencing technology. We also present a set of methods for annotating sequences deriving from known miRNAs, identifying variability in mature miRNA sequences, and identifying sequences belonging to previously unidentified miRNA genes. Application of this approach to RNA from human embryonic stem cells obtained before and after their differentiation into embryoid bodies revealed the sequences and expression levels of 334 known plus 104 novel miRNA genes. One hundred seventy-one known and 23 novel microRNA sequences exhibited significant expression differences between these two developmental states. Owing to the increased number of sequence reads, these libraries represent the deepest miRNA sampling to date, spanning nearly six orders of magnitude of expression. The predicted targets of those miRNAs enriched in either sample shared common features. Included among the high-ranked predicted gene targets are those implicated in differentiation, cell cycle control, programmed cell death, and transcriptional regulation.

Summary

 The development of precision medicine approaches for diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is confounded by its pronounced genetic, phenotypic, and clinical heterogeneity. Recent multiplatform genomic studies revealed the existence of genetic subtypes of DLBCL using clustering methodologies. Here, we describe an algorithm that determines the probability that a patient's lymphoma belongs to one of seven genetic subtypes based on its genetic features. This classification reveals genetic similarities between these DLBCL subtypes and various indolent and extranodal lymphoma types, suggesting a shared pathogenesis. These genetic subtypes also have distinct gene expression profiles, immune microenvironments, and outcomes following immunochemotherapy. Functional analysis of genetic subtype models highlights distinct vulnerabilities to targeted therapy, supporting the use of this classification in precision medicine trials.

Granulosa-cell tumors (GCTs) are the most common type of malignant ovarian sex cord-stromal tumor (SCST). The pathogenesis of these tumors is unknown. Moreover, their histopathological diagnosis can be challenging, and there is no curative treatment beyond surgery.We analyzed four adult-type GCTs using whole-transcriptome paired-end RNA sequencing. We identified putative GCT-specific mutations that were present in at least three of these samples but were absent from the transcriptomes of 11 epithelial ovarian tumors, published human genomes, and databases of single-nucleotide polymorphisms. We confirmed these variants by direct sequencing of complementary DNA and genomic DNA. We then analyzed additional tumors and matched normal genomic DNA, using a combination of direct sequencing, analyses of restriction-fragment-length polymorphisms, and TaqMan assays.All four index GCTs had a missense point mutation, 402C-->G (C134W), in FOXL2, a gene encoding a transcription factor known to be critical for granulosa-cell development. The FOXL2 mutation was present in 86 of 89 additional adult-type GCTs (97%), in 3 of 14 thecomas (21%), and in 1 of 10 juvenile-type GCTs (10%). The mutation was absent in 49 SCSTs of other types and in 329 unrelated ovarian or breast tumors.Whole-transcriptome sequencing of four GCTs identified a single, recurrent somatic mutation (402C-->G) in FOXL2 that was present in almost all morphologically identified adult-type GCTs. Mutant FOXL2 is a potential driver in the pathogenesis of adult-type GCTs.

Genomic profiling has identified a subtype of high-risk B-progenitor acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) with alteration of IKZF1, a gene expression profile similar to BCR-ABL1-positive ALL and poor outcome (Ph-like ALL). The genetic alterations that activate kinase signaling in Ph-like ALL are poorly understood. We performed transcriptome and whole genome sequencing on 15 cases of Ph-like ALL and identified rearrangements involving ABL1, JAK2, PDGFRB, CRLF2, and EPOR, activating mutations of IL7R and FLT3, and deletion of SH2B3, which encodes the JAK2-negative regulator LNK. Importantly, several of these alterations induce transformation that is attenuated with tyrosine kinase inhibitors, suggesting the treatment outcome of these patients may be improved with targeted therapy.

Rhodococcus sp. RHA1 (RHA1) is a potent polychlorinated biphenyl-degrading soil actinomycete that catabolizes a wide range of compounds and represents a genus of considerable industrial interest. RHA1 has one of the largest bacterial genomes sequenced to date, comprising 9,702,737 bp (67% G+C) arranged in a linear chromosome and three linear plasmids. A targeted insertion methodology was developed to determine the telomeric sequences. RHA1's 9,145 predicted protein-encoding genes are exceptionally rich in oxygenases (203) and ligases (192). Many of the oxygenases occur in the numerous pathways predicted to degrade aromatic compounds ( 30 ) or steroids ( 4 ). RHA1 also contains 24 nonribosomal peptide synthase genes, six of which exceed 25 kbp, and seven polyketide synthase genes, providing evidence that rhodococci harbor an extensive secondary metabolism. Among sequenced genomes, RHA1 is most similar to those of nocardial and mycobacterial strains. The genome contains few recent gene duplications. Moreover, three different analyses indicate that RHA1 has acquired fewer genes by recent horizontal transfer than most bacteria characterized to date and far fewer than Burkholderia xenovorans LB400, whose genome size and catabolic versatility rival those of RHA1. RHA1 and LB400 thus appear to demonstrate that ecologically similar bacteria can evolve large genomes by different means. Overall, RHA1 appears to have evolved to simultaneously catabolize a diverse range of plant-derived compounds in an O 2 -rich environment. In addition to establishing RHA1 as an important model for studying actinomycete physiology, this study provides critical insights that facilitate the exploitation of these industrially important microorganisms.

Abstract Next-generation sequencing of follicular lymphoma and diffuse-large B-cell lymphoma has revealed frequent somatic, heterozygous Y641 mutations in the histone methyltransferase EZH2. Heterozygosity and the presence of equal quantities of both mutant and wild-type mRNA and expressed protein suggest a dominant mode of action. Surprisingly, B-cell lymphoma cell lines and lymphoma samples harboring heterozygous EZH2Y641 mutations have increased levels of histone H3 Lys-27–specific trimethylation (H3K27me3). Expression of EZH2Y641F/N mutants in cells with EZH2WT resulted in an increase of H3K27me3 levels in vivo. Structural modeling of EZH2Y641 mutants suggests a “Tyr/Phe switch” model whereby structurally neutral, nontyrosine residues at position 641 would decrease affinity for unmethylated and monomethylated H3K27 substrates and potentially favor trimethylation. We demonstrate, using in vitro enzyme assays of reconstituted PRC2 complexes, that Y641 mutations result in a decrease in monomethylation and an increase in trimethylation activity of the enzyme relative to the wild-type enzyme. This represents the first example of a disease-associated gain-of-function mutation in a histone methyltransferase, whereby somatic EZH2 Y641 mutations in lymphoma act dominantly to increase, rather than decrease, histone methylation. The dominant mode of action suggests that allele-specific EZH2 inhibitors should be a future therapeutic strategy for this disease.