SUMMARY The tumor suppressor NF1 is a critical driver of sporadic breast cancer and NF-related breast cancers. We utilized distinct Nf1 -deficient immunocompetent rat models to investigate Nf1 function in mammary development and homeostasis. Here we demonstrate that Nf1 deficiency dramatically accelerates mammary morphogenesis, alters TEB cell organization, and proliferation. Notably, we observed a shift in luminal-basal epithelial lineage commitment within Nf1 -deficient lines with early tumor onset. In addition, we detected subpopulations of hybrid EMT cells (Ecad + /CK14 + ) within the invasive edge and stroma of Nf1 -deficient tumors. Nf1 deficiency restricted luminal progenitor potential and resulted in gene expression changes associated with decreased cell adhesion and increased EMT signatures. Together our findings support a model in which Nf1 loss of function results in lineage plasticity throughout mammary morphogenesis and promotes EMT-mediated invasion. This study reveals a previously unknown role for the tumor suppressor neurofibromin in mammary homeostasis and phenotypic plasticity during breast cancer progression.

ABSTRACT Objective NF1 is a tumor suppressor gene and its protein product, neurofibromin, is the key negative regulator of the RAS pathway. NF1 is one of the top driver mutations in sporadic breast cancer such that 27% of breast cancers exhibit damaging NF1 alterations. NF1 loss-of-function is a frequent event in the genomic evolution of estrogen receptor (ER)+ breast cancer metastasis and endocrine resistance. Individuals with Neurofibromatosis type 1 (NF) – a disorder caused by germline NF1 mutations – have an increased risk of dying from breast cancer [1–4]. NF-related breast cancers are associated with decreased overall survival compared to sporadic breast cancer. Despite numerous studies interrogating the role of RAS mutations in tumor metabolism, no study has comprehensively profiled the NF1 -mutant breast cancer metabolome to define patterns of energetic and metabolic reprogramming. The goals of this investigation were (1) to define the role of NF1 deficiency in estrogen receptor-positive (ER+) breast cancer metabolic reprogramming and (2) to identify potential targeted pathway and metabolic inhibitor combination therapies for NF1 -deficient ER+ breast cancer. Methods We employed two ER+ NF1 -deficient breast cancer models: (1) an NF1 -mutant MCF7 breast cancer cell line to model sporadic breast cancer, and (2) three distinct, Nf1 -deficient rat models to model NF- related breast cancer [1]. IncuCyte proliferation analysis was used to measure the effect of NF1 deficiency on cell proliferation and drug response. Protein quantity was assessed by Western Blot analysis. We then used RNAseq to investigate the transcriptional effect of NF1 deficiency on global and metabolism-related transcription. We measured cellular energetics using Agilent Seahorse XF-96 Glyco Stress Test and Mito Stress Test assays. We performed stable isotope labeling and measured [U- 13 C]- glucose and [U- 13 C]-glutamine metabolite incorporation and measured total metabolite pools using mass spectrometry. Lastly, we used a Bliss synergy model to investigate NF1 -driven changes in targeted and metabolic inhibitor synergy. Results Our results revealed that NF1 deficiency enhanced cell proliferation, altered neurofibromin expression, and increased RAS and PI3K/AKT pathway signaling while constraining oxidative ATP production and restricting energetic flexibility. Neurofibromin deficiency also increased glutamine influx into TCA intermediates and dramatically increased lipid pools, especially triglycerides (TG). Lastly, NF1 deficiency alters the synergy between metabolic inhibitors and traditional targeted inhibitors. This includes increased synergy with inhibitors targeting glycolysis, glutamine metabolism, mitochondrial fatty acid transport, and TG synthesis. Conclusions NF1 deficiency drives metabolic reprogramming in ER+ breast cancer. This reprogramming is characterized by oxidative ATP constraints, glutamine TCA influx, and lipid pool expansion, and these metabolic changes introduce novel metabolic-to-targeted inhibitor synergies. HIGHLIGHTS NF1 deficiency drives metabolic reprogramming in ER+ breast cancer. NF1 -driven metabolic reprogramming is characterized by oxidative ATP constraints, glutamine TCA influx, and lipid pool expansion. NF1 -deficient ER+ breast cancer cells have increased sensitivity to a combination of RAS and triglyceride synthesis inhibitors. Graphical Abstract

ABSTRACT BACKGROUND Neurofibromin, coded by the NF1 tumor suppressor gene, is the main negative regulator of the RAS pathway and is frequently mutated in various cancers. Women with Neurofibromatosis Type I (NF1) – a tumor predisposition syndrome caused by a germline NF1 mutation – have an increased risk of developing aggressive breast cancer with poorer prognosis. The mechanism by which NF1 mutations lead to breast cancer tumorigenesis is not well understood. Therefore, the objective of this work was to identify stromal alterations before tumor formation that result in the increased risk and poorer outcome seen among NF1 patients with breast cancer. METHODS To accurately model the germline monoallelic NF1 mutations in NF1 patients, we utilized an Nf1- deficient rat model with accelerated mammary development before presenting with highly penetrant breast cancer. RESULTS We identified increased collagen content in Nf1 -deficient rat mammary glands before tumor formation that correlated with age of tumor onset. Additionally, gene expression analysis revealed that Nf1 -deficient mature adipocytes in the rat mammary gland have increased collagen expression and shifted to a fibroblast and preadipocyte expression profile. This alteration in lineage commitment was also observed with in vitro differentiation, however, flow cytometry analysis did not show a change in mammary adipose-derived mesenchymal stem cell abundance. CONCLUSION Collectively, these studies uncovered the previously undescribed role of Nf1 in mammary collagen deposition and regulating adipocyte differentiation. In addition to unraveling the mechanism of tumor formation, further investigation of adipocytes and collagen modifications in preneoplastic mammary glands will create a foundation for developing early detection strategies of breast cancer among NF1 patients. GRAPHICAL ABSTRACT

Abstract The key negative regulatory gene of the RAS pathway, NF1 , is mutated or deleted in numerous cancer types and is associated with increased cancer risk and drug resistance. Even though women with neurofibromatosis (germline NF1 mutations) have a substantially increased breast cancer risk at a young age and NF1 is commonly mutated in sporadic breast cancers, we have a limited understanding of the role of NF1 in breast cancer. Much of our understanding of the mechanisms underlying the functional loss of NF1 comes from mouse models that do not completely recapitulate the phenotypes of human NF1 . We utilized CRISPR-Cas9 gene editing to create Nf1 rat models to evaluate the effect of Nf1 deficiency on tumorigenesis. The resulting Nf1 indels induced highly penetrant, aggressive mammary adenocarcinomas that express estrogen receptor and progesterone receptor. We identified distinct Nf1 isoforms that were altered during tumorigenesis. To evaluate NF1 in human breast cancer, we analyzed genomic changes in a breast cancer dataset of 2,000 clinically annotated breast cancers. We found NF1 shallow deletions in 25% of sporadic breast cancers, which correlated with poor clinical outcome. To identify biological networks impacted by NF1 deficiency, we constructed gene co-expression networks using weighted gene correlation network analysis (WGCNA) and identified a network connected to ESR1 (estrogen receptor). Moreover, NF1 -deficient cancers correlated with established RAS activation signatures. Estrogen-dependence was verified by estrogen-ablation in Nf1 rats where rapid tumor regression was observed. These results demonstrated the significant role NF1 plays in both NF1-related breast cancer and sporadic breast cancer.

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are highly resistant sarcomas that occur in up to 13% of individuals with Neurofibromatosis Type 1 (NF1). Genomic analysis of longitudinally collected tumor samples in a case of MPNST disease progression revealed early hemizygous microdeletions in NF1 and TP53, with concomitant amplifications of MET, HGF, and EGFR. To examine the role of MET in MPNST progression, we developed mice with enhanced MET expression and NF1 ablation (NF1fl/KO;lox-stop-loxMETtg/+;Plp-creERTtg/+; referred to as NF1-MET). NF1-MET mice express a robust MPNST phenotype in the absence of additional mutations. A comparison of NF1-MET MPSNTs with MPNSTs derived from NF1KO/+;p53R172H;Plp-creERTtg/+ (NF1-P53) and NF1KO/+;Plp-creERTtg/+ (NF1) mice revealed unique Met, Ras, and PI3K signaling patterns. To investigate the therapeutic potential of MET inhibition among tumorgrafts derived from the respective MPNST models, we tested the highly selective MET inhibitor, capmatinib. NF1-MET MPNSTs were uniformly sensitive to MET inhibition whereas only a small subset of NF1-P53 and NF1 MPNSTs were inhibited. These results confirm that MET activation is sufficient for Schwann cell dedifferentiation into MPNSTs in the context of NF1 deficiency. RAS-MET signal interactions may be an important driver of MPSNT disease progression.

We previously reported that cooperative RAS-MET signaling drives disease progression in NF1-related MPNSTs, and that MET inhibition results in downstream inhibition of RAS/MAPK in the context of MET amplification. This study revealed that response to MET inhibition appeared to be modulated by P53 gene status. It is currently unclear how P53 function affects kinome signaling and response to kinase inhibition. Here we utilized genetically engineered mouse models with variable levels of Met and Hgf amplification and differential p53 status (NF1fl/KO;lox- stop-loxMETtg/+;Plp-creERTtg/+; NF1+/KO;p53R172H;Plp-creERTtg/+; and NF1+/KO;Plp-creERTtg/+t). These NF1-MPNST models were used to assess a novel MET/MEK (i.e. RAS-MET) inhibition strategy and investigate the adaptive kinome response to MET and MEK inhibition. We demonstrate that combination MET (capmatinib) and MEK (trametinib) inhibition fully suppresses MET, RAS/MAPK, and PI3K/AKT activation in P53 wild type tumors, whereas P53-mutant tumors demonstrated sustained CRAF, BRAF, and AKT activation in the presence of combined MET and MEK inhibition. Interestingly, trametinib therapy alone strongly activates MET signaling in MET and HGF-amplified tumors regardless of P53 status, an effect that was abrogated by the addition of capmatinib. We conclude that P53 alters RAS-MET signaling interactions that drive therapy resistance in NF1-related MPNSTs.

Abstract Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are chemotherapy resistant sarcomas that are a leading cause of death in neurofibromatosis type 1 (NF1). Although NF1-related MPNSTs derive from neural crest cell origin, they also exhibit intratumoral heterogeneity. TP53 mutations are associated with significantly decreased survival in MPNSTs, however the mechanisms underlying TP53- mediated therapy responses are unclear in the context of NF1 -deficiency. We evaluated the role of two commonly altered genes, MET and TP53 , in kinome reprograming and cellular differentiation in preclinical MPNST mouse models. We previously showed that MET amplification occurs early in human MPNST progression and that Trp53 loss abrogated MET-addiction resulting in MET inhibitor resistance. Here we demonstrate a novel mechanism of therapy resistance whereby p53 alters MET stability, localization, and downstream signaling leading to kinome reprogramming and lineage plasticity. Trp53 loss also resulted in a shift from RAS/ERK to AKT signaling and enhanced sensitivity to MEK and mTOR inhibition. In response to MET, MEK and mTOR inhibition, we observed broad and heterogeneous activation of key differentiation genes in Trp53 -deficient lines suggesting Trp53 loss also impacts lineage plasticity in MPNSTs. These results demonstrate the mechanisms by which p53 loss alters MET dependency and therapy resistance in MPNSTS through kinome reprogramming and phenotypic flexibility.