Model building into experimental maps is a key element of structural biology, but can be both time consuming and error prone for low-resolution maps. Here we present Namdinator, an easy-to-use tool that enables the user to run a molecular dynamics flexible fitting simulation followed by real-space refinement in an automated manner through a pipeline system. Namdinator will modify an atomic model to fit within cryo-EM or crystallography density maps, and can be used advantageously for both the initial fitting of models, and for a geometrical optimization step to correct outliers, clashes and other model problems. We have benchmarked Namdinator against 39 deposited cryo-EM models and maps, and observe model improvements in 34 of these cases (87%). Clashes between atoms were reduced, and the model-to-map fit and overall model geometry were improved, in several cases substantially. We show that Namdinator is able to model large-scale conformational changes compared to the starting model. Namdinator is a fast and easy tool for structural model builders at all skill levels. Namdinator is available as a web service (https://namdinator.au.dk), or it can be run locally as a command-line tool.

Abstract Model building into experimental maps is a key element of structural biology, but can be both time consuming and error-prone. Here we present Namdinator, an easy-to-use tool that enables the user to run a Molecular Dynamics Flexible Fitting (MDFF) simulation in an automated manner through a pipeline system. Namdinator will modify an atomic model to fit within cryo-EM or crystallography density maps, and can be used advantageously for both the initial fitting of models, and for a geometrical optimization step to correct outliers, clashes and other model problems. We have benchmarked Namdinator against 39 deposited models and maps from cryo-EM and observe model improvements in 34 of these cases (87%). Clashes between atoms were reduced, and model-to-map fit and overall model geometry were improved, in several cases substantially. We show that Namdinator is able to model large scale conformational changes compared to the starting model. Namdinator is a fast and easy way to create suitable initial models for both cryo-EM and crystallography. It can fix model errors in the final steps of model building, and is usable for structural model builders at all skill levels. Namdinator is available as a web service ( https://namdinator.au.dk ), or can be run locally as a command-line tool. Synopsis A pipeline tool called Namdinator is presented that enables the user to run a Molecular Dynamics Flexible Fitting (MDFF) simulation in a fully automated manner, both online and locally. This provides a fast and easy way to create suitable initial models for both cryo-EM and crystallography and help fix errors in the final steps of model building.

Abstract The sodium-potassium-chloride transporter NKCC1 (SLC12A2) performs Na + -dependent Cl − and K + ion uptake across plasma membranes. NKCC1 is important for regulating e.g. cell volume, hearing, blood pressure, and chloride gradients defining GABAergic and glycinergic signaling in brain. Here, we present a 2.6 Å resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of human NKCC1 in the substrate-loaded (Na + , K + , 2 Cl − ) and inward-facing conformation adopting an occluded state that has also been observed for the SLC6 type transporters MhsT and LeuT. Cl − binding at the Cl1 site together with the nearby K + ion provide a crucial bridge between the LeuT-fold scaffold and bundle domains. Cl − ion binding at the Cl2 site seems to undertake a structural role similar to a conserved glutamate of SLC6 transporters and may allow for chloride-sensitive regulation of transport. Supported by functional studies in mammalian cells and computational simulations we describe the Na + binding site and a putative Na + release pathway along transmembrane helix 5. The results provide insight into the structure-function relationship of NKCC1 with broader implications for other SLC12 family members.

P4-ATPases are lipid flippases that drive active transport of phospholipids from the exoplasmic or lumenal to the cytosolic leaflets of eukaryotic membranes to maintain their asymmetric lipid composition. The molecular architecture of P4-ATPases and how they work in lipid recognition and transport has remained elusive. Using cryo-electron microscopy we have determined the structures of a P4-ATPase, specifically of the Saccharomyces cerevisiae Drs2p-Cdc50p, which is a phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine specific lipid flippase. Drs2p-Cdc50p is autohihibited by the Drs2p C-terminal tail and activated by phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P). We present three structures representing an autoinhibited, an intermediate, and a fully activated state. The analysis highlights specific features of P4-ATPases and reveals sites of auto-inhibition and PI4P-dependent activation. We observe the opening of a putative flippase pathway engaging conserved residues Ile508 of transmembrane segment 4 and Lys1018 and polar residues of transmembrane segment 5 in the centre of the lipid bilayer.

ABSTRACT Phosphorus is an essential macronutrient for all microorganisms and can be extracted from the environment by several metabolic pathways. In Escherichia coli, the 14-cistron phn operon encoding the carbon-phosphorus (C-P) lyase enzymatic machinery allows for extraction of phosphorus from a wide range of phosphonates characterised by the highly stable C-P bond. 1, 2 As part of a complex, multi-step pathway, the PhnJ subunit was proposed to cleave the C-P bond via a radical reaction, however, the details of the mechanism were not immediately compatible with the structure of the 220 kDa PhnGHIJ C-P lyase core complex, leaving a significant gap in our understanding of phosphonate breakdown in bacteria. 3, 4 Here we show using single-particle cryogenic-electron microscopy that PhnJ mediates binding of a unique double dimer of ATP-binding cassette (ABC) proteins, PhnK and PhnL to the core complex. ATP hydrolysis by PhnK induces drastic structural remodelling leading to opening of the core and reconfiguration of a metal-binding site located at the interface between the PhnI and PhnJ subunits. Our results offer new insights into the mechanism underlying C-P lyase and uncover a hitherto unknown configuration of ABCs that have wide-ranging implications for our understanding of the role of this module in biological systems.