Abstract Background Arthropods comprise the largest and most diverse phylum on Earth and play vital roles in nearly every ecosystem. Their diversity stems in part from variations on a conserved body plan, resulting from and recorded in adaptive changes in the genome. Dissection of the genomic record of sequence change enables broad questions regarding genome evolution to be addressed, even across hyper-diverse taxa within arthropods. Results Using 76 whole genome sequences representing 21 orders spanning more than 500 million years of arthropod evolution, we document changes in gene and protein domain content and provide temporal and phylogenetic context for interpreting these innovations. We identify many novel gene families that arose early in the evolution of arthropods and during the diversification of insects into modern orders. We reveal unexpected variation in patterns of DNA methylation across arthropods and examples of gene family and protein domain evolution coincident with the appearance of notable phenotypic and physiological adaptations such as flight, metamorphosis, sociality and chemoperception. Conclusions These analyses demonstrate how large-scale comparative genomics can provide broad new insights into the genotype to phenotype map and generate testable hypotheses about the evolution of animal diversity.

Genome sequencing quality, in terms of both read length and accuracy, is constantly improving. By combining long-read sequencing technologies with various scaffolding techniques, chromosome-level genome assemblies are now achievable at an affordable price for non-model organisms. Insects represent an exciting taxon for studying the genomic underpinnings of evolutionary innovations, due to ancient origins, immense species-richness, and broad phenotypic diversity. Here we summarize some of the most important methods for carrying out a comparative genomics study on insects. We describe available tools and offer concrete tips on all stages of such an endeavor from DNA extraction through genome sequencing, annotation, and several evolutionary analyses. Along the way we describe important insect-specific aspects, such as DNA extraction difficulties or gene families that are particularly difficult to annotate, and offer solutions. We describe results from several examples of comparative genomics analyses on insects to illustrate the fascinating questions that can now be addressed in this new age of genomics research.

Abstract De novo genes are novel genes which emerge from non-coding DNA. Until now, little is known about de novo genes properties, correlated to their age and mechanisms of emergence. In this study, we investigate four properties: introns, upstream regulatory motifs, 5’ UTRs and protein domains, in 23135 human proto-genes. We found that proto-genes contain introns, whose number and position correlates with the genomic position of proto-gene emergence. The origin of these introns is debated, as our result suggest that 41% proto-genes might have captured existing introns, as well as the fact that 13.7% of them do not splice the ORF. We show that proto-genes which emerged via overprinting tend to be more enriched in core promotor motifs, while intergenic and intronic ones are more enriched in enhancers, even if the motif TATA is most expressed upstream these genes. Intergenic and intronic 5’ UTRs of protogenes have a lower potential to stabilise mRNA structures than exonic proto-genes and established human genes. Finally, we confirm that proto-genes gain new putative domains with age. Overall, we find that regulatory motifs inducing transcription and translation of previously non-coding sequences may facilitate proto-gene emergence. Our paper demonstrates that introns, 5’UTRs, and domains have specific properties in proto-genes. We also show the importance of studying proto-genes in relation to their genomic position, as it strongly impacts these properties.

Abstract The reproductive castes of eusocial insects are often characterised by extreme lifespans and reproductive output, indicating an absence of the fecundity/longevity trade-off. The role of DNA methylation in the regulation of caste- and age-specific gene expression in eusocial insects is controversial. While some studies find a clear link to caste formation in honeybees and ants, others find no correlation when replication is increased across independent colonies. Although recent studies have identified transcription patterns involved in the maintenance of high reproduction throughout the long lives of queens, the role of DNA methylation in the regulation of these genes is unknown. We carried out a comparative analysis of DNA methylation in the regulation of caste-specific transcription and its importance for the regulation of fertility and longevity in queens of the higher termite, Macrotermes natalensis . We found evidence for significant, well-regulated changes in DNA methylation in mature compared to young queens, especially in several genes related to ageing and fecundity in mature queens. We also found a strong link between methylation and caste-specific alternative splicing. This study reveals a complex regulatory role of fat body DNA methylation both in the division of labour in termites, and during the reproductive maturation of queens.

Abstract Domains as functional protein units and their rearrangements along the phylogeny can shed light on the functional changes of proteomes associated with the evolution of complex traits like eusociality. This complex trait is associated with sterile soldiers and workers, and long-lived, highly fecund reproductives. Unlike in Hymenotpera (ants, bees, and wasps), the evolution of eusociality within Blattodea, where termites evolved from within cockroaches, was accompanied by a reduction in proteome size, raising the question of whether functional novelty was achieved with existing rather than novel proteins. To address this, we investigated the role of domain rearrangements during the evolution of termite eusociality. Analysing domain rearrangements in the proteomes of three solitary cockroaches and five eusocial termites, we inferred more than 5000 rearrangements over the phylogeny of Blattodea. The 90 novel domain arrangements that emerged at the origin of termites were enriched for several functions related to longevity, such as protein homeostasis, DNA repair, mitochondrial activity, and nutrient sensing. Many domain rearrangements were related to changes in developmental pathways, important for the emergence of novel castes. Along with the elaboration of social complexity, including permanently sterile workers and larger, foraging colonies, we found 110 further domain arrangements with functions related to protein glycosylation and ion transport. We found an enrichment of caste-biased expression and splicing within rearranged genes, highlighting their importance for the evolution of castes. Furthermore, we found increased levels of DNA methylation among rearranged compared to non-rearranged genes suggesting fundamental differences in their regulation. Our findings indicate an importance of domain rearrangements in the generation of functional novelty necessary for termite eusociality to evolve.

Characterizing the adaptive landscapes that encompass the emergence of novel enzyme functions can provide molecular insights into both enzymatic and evolutionary mechanisms. Here, we combine ancestral protein reconstruction with biochemical, structural, and mutational analyses to characterize the functional evolution of methyl-parathion hydrolase (MPH), a xenobiotic organophosphate-degrading enzyme. We identify five mutations that are necessary and sufficient for the evolution of MPH from an ancestral dihydrocoumarin hydrolase. In-depth analyses of the adaptive landscapes encompassing this evolutionary transition revealed that a complex interaction network, defined in part by higher-order epistasis, determined the adaptive pathways that were available. By also characterizing the adaptive landscapes in terms of their functional activity towards three other OP substrates, we reveal that subtle differences in substrate substituents drastically alter the enzymes epistatic network by changing its intramolecular interactions. Our work suggests that the mutations function collectively to enable substrate recognition via subtle structural repositioning.