In antiviral RNA interference (RNAi), the DICER enzyme processes virus-derived double-stranded RNA (dsRNA) into small interfering RNAs (siRNAs) that guide ARGONAUTE proteins to silence complementary viral RNA. As a counterdefense, viruses deploy viral suppressors of RNAi (VSRs). Well-established in plants and invertebrates, the existence of antiviral RNAi remains unknown in mammals. Here, we show that undifferentiated mouse cells infected with encephalomyocarditis virus (EMCV) or Nodamura virus (NoV) accumulate ~22-nucleotide RNAs with all the signature features of siRNAs. These derive from viral dsRNA replication intermediates, incorporate into AGO2, are eliminated in Dicer knockout cells, and decrease in abundance upon cell differentiation. Furthermore, genetically ablating a NoV-encoded VSR that antagonizes DICER during authentic infections reduces NoV accumulation, which is rescued in RNAi-deficient mouse cells. We conclude that antiviral RNAi operates in mammalian cells.

DNA methylation is essential for silencing transposable elements and some genes in higher eukaryotes, which suggests that this modification must be tightly controlled. However, accidental changes in DNA methylation can be transmitted through mitosis (as in cancer) or meiosis, leading to epiallelic variation. We demonstrated the existence of an efficient mechanism that protects against transgenerational loss of DNA methylation in Arabidopsis . Remethylation is specific to the subset of heavily methylated repeats that are targeted by the RNA interference (RNAi) machinery. This process does not spread into flanking regions, is usually progressive over several generations, and faithfully restores wild-type methylation over target sequences in an RNAi-dependent manner. Our findings suggest an important role for RNAi in protecting genomes against long-term epigenetic defects.

Abstract Dead End (DND1) is an RNA-binding protein essential for germline development through its role in post-transcriptional gene regulation. The molecular mechanisms behind selection and regulation of its targets are unknown. Here, we present the solution structure of DND1’s tandem RNA Recognition Motifs (RRMs) bound to AU-rich RNA. The structure reveals how an NYAYUNN element is specifically recognized, reconciling seemingly contradictory sequence motifs discovered in recent genome-wide studies. RRM1 acts as a main binding platform, including atypical extensions to the canonical RRM fold. RRM2 acts cooperatively with RRM1, capping the RNA using an unusual binding pocket, leading to an unprecedented mode of tandem RRM-RNA recognition. We show that the consensus motif is sufficient to mediate upregulation of a reporter gene in human cells and that this process depends not only on RNA binding by the RRMs, but also on DND1’s double-stranded RNA binding domain (dsRBD), which is dispensable for target binding in cellulo . Our results point to a model where DND1 target selection is mediated by a non-canonical mode of AU-rich RNA recognition by the tandem RRMs and a role for the dsRBD in the recruitment of effector complexes responsible for target regulation.

SUMMARY MicroRNA (miRNA) loaded Argonaute (AGO) complexes regulate gene expression via direct base pairing with their mRNA targets. Current prediction approaches identified that between 20 to 60% of mammalian transcriptomes are regulated by miRNAs, but it remains largely unknown which fraction of these interactions are functional in a specific cellular context. Here, we integrated transcriptome data from a set of miRNA-depleted mouse embryonic stem cell (mESC) lines with published miRNA interaction predictions and AGO-binding profiles. This integrative approach, combined with molecular validation data, identified that only 6% of expressed genes are functionally and directly regulated by miRNAs in mESCs. In addition, analyses of the stem cell-specific miR-290-295 cluster target genes identified TFAP4 as an important transcription factor for early development. The extensive datasets developed in this study will support the development of improved predictive models for miRNA-mRNA functional interactions.

ABSTRACT The Argonaute proteins (AGO) are well-known for their essential role in post-transcriptional gene silencing in the microRNA (miRNA) biogenesis pathway. Only two AGOs (AGO1 and AGO2) are expressed in mouse embryonic stem cells (mESCs). The transcriptome of Ago mutant mESCs revealed a large and specific set of misregulated genes, compared to other miRNA biogenesis factor mutant cells, suggesting additional functions for the AGOs in stem cells. In this study, we endeavored to understand miRNA-independent roles of the AGOs in gene expression regulation through the integration of multiple datasets. Correlation of Ago mutant differential gene expression with ENCODE histone modification data of WT mESCs revealed that affected genes were regulated by the repressive histone modification H3K27me3. We validated this observation by performing chromatin immunoprecipitation followed by sequencing and observed a global loss of H3K27me3 in Ago mutant cells. Nevertheless, this reduction explains only a small part of the specific differential gene expression observed in Ago mutant mESCs. By integrating chromatin accessibility data in conjunction with prediction of transcription factor binding sites, we identified differential binding for five transcription factors, including KLF4 as a key modulator of more than half of the specific misregulation of gene expression in the absence of AGO proteins. Our findings illustrate that in addition to chromatin state, information about transcription factor binding is more revelatory in understanding the multi-layered mechanism adopted by cells to regulate gene expression. These data also highlight the importance of an integrative approach to unravel the variety of noncanonical functions of AGOs in mESCs.

ABSTRACT Argonaute proteins (AGOs), that play an essential role in cytosolic post-transcriptional gene silencing, have been also reported to function in nuclear processes like transcriptional activation or repression, alternative splicing and, chromatin organization. As most of these studies have been conducted in human cancer cell lines, the relevance of AGOs nuclear functions in the context of mouse early embryonic development remains uninvestigated. Here, we examined a possible role of the AGO1 protein on the distribution of constitutive heterochromatin in mouse Embryonic Stem Cells (mESCs). We observed a specific redistribution of the repressive histone mark H3K9me3 and the heterochromatin protein HP1α, away from pericentromeric regions upon Ago1 depletion. Furthermore, we demonstrated that major satellite transcripts are strongly upregulated in Ago1 _KO mESCs and that their levels are partially restored upon AGO1 rescue. We also observed a similar redistribution of H3K9me3 and HP1α in Drosha _KO mESCs, suggesting a role for microRNAs (miRNAs) in the regulation of heterochromatin distribution in mESCs. Finally, we showed that specific miRNAs with complementarity to major satellites can partially regulate the expression of these transcripts. Summary blurb Depletion of AGO1 in mESCs leads to a redistribution of H3K9me3 and HP1α away from pericentromeric regions and is accompanied by an upregulation of major satellites transcripts.

The development of in vitro models, which accurately recapitulate early embryonic development, is one of the fundamental challenges in stem cell research. Most of the currently employed approaches involve the culture of embryonic stem cells (ESCs) on two-dimensional (2D) surfaces. However, the monolayer nature of these cultures does not permit cells to grow and proliferate in realistic three-dimensional (3D) microenvironments, as in an early embryo. In this paper, novel 3D synthetic scaffold arrays, fabricated by two-photon polymerization photolithography, are utilized to mimic tissue-specific architecture, enabling cell-to-matrix interaction and cell-to-cell communication in vitro . Mouse ESCs (mESCs) are able to grow and proliferate on these structures and maintain their pluripotent state. Furthermore, the 3D microscaffold arrays are integrated into a microscopy slide allowing the evaluation of the expression of key pluripotency factors at the single-cell level. Comparing 2D and 3D surfaces, mESCs grown in serum+LIF on 3D microscaffolds exhibit a stronger and more homogenous expression of NANOG and OCT4 pluripotency factors, than cells cultivated in 2i media, demonstrating that 3D microscaffolds capture naive pluripotency in vitro . Thus, the slide affords a novel and unique tool to model and study mammalian early development with greater physiological relevance than conventional 2D cultures.

Abstract LINE-1 (L1) are autonomous retroelements that have retained their ability to mobilize. Mechanisms regulating L1 mobility include DNA methylation in somatic cells and the Piwi-interacting RNA pathway in the germline. During pre-implantation stages of mouse embryonic development, however, both pathways are inactivated leading to a critical window necessitating alternate means of L1 regulation. We previously reported an increase in L1 levels in Dicer_ KO mouse embryonic stem cells (mESCs). Intriguingly this was accompanied by only a marginal increase in retrotransposition, suggestive of additional mechanisms suppressing L1 mobility. Here, we demonstrate that L1 Ribonucleoprotein complexes (L1 RNP) accumulate as aggregates in Dicer_ KO cytoplasm along with the RNA helicase MOV10. The combined overexpression of L1 RNAs and MOV10 is sufficient to create L1 RNP aggregates in stem cells. In Dicer _KO mESCs, MOV10 is upregulated due to the loss of its direct regulation by miRNAs. The newly discovered post-transcriptional regulation of Mov10 expression, and its role in preventing L1 retrotransposition by driving novel cytosolic aggregation affords alternate routes to explore for therapy and disease progression.

Posttranscriptional repression by microRNA (miRNA) occurs through transcript destabilization or translation inhibition. Whereas RNA degradation explains most miRNA-dependent repression, transcript decay occurs co-translationally, raising questions regarding the requirement of target translation to miRNA-dependent transcript destabilization. To assess the contribution of translation to miRNA-mediated RNA destabilization, we decoupled these two molecular processes by dissecting the impact of miRNA loss of function on cytosolic long noncoding RNAs (lncRNAs). We show, that despite interacting with miRNA loaded RNA-induced silencing complex (miRISC), the steady state abundance and degradation rates of these endogenously expressed non-translated transcripts are minimally impacted by miRNA loss. To validate the requirement of translation for miRNA-dependent decay, we fused a miRISC bound lncRNA, whose levels are unaffected by miRNAs, to the 3 prime end of a protein-coding gene reporter and show that this results in its miRNA-dependent transcript destabilization. Furthermore, analysis of the few lncRNAs whose levels are regulated by miRNAs revealed these tend to associate with translating ribosomes and are likely misannotated micropeptides, further substantiating the necessity of target translation for miRNA-dependent transcript decay. Our analyses reveal the strict requirement of translation for miRNA-dependent transcript destabilization and demonstrate that the levels of coding and noncoding transcripts are differently affected by miRNAs.