This protocol describes stepwise differentiation of human pluripotent stem cells into 3D kidney organoids that contain segmented nephrons connected to collecting ducts, which are surrounded by renal interstitial cells and an endothelial network. The human kidney develops from four progenitor populations—nephron progenitors, ureteric epithelial progenitors, renal interstitial progenitors and endothelial progenitors—resulting in the formation of maximally 2 million nephrons. Until recently, the reported methods differentiated human pluripotent stem cells (hPSCs) into either nephron progenitor or ureteric epithelial progenitor cells, consequently forming only nephrons or collecting ducts, respectively. Here we detail a protocol that simultaneously induces all four progenitors to generate kidney organoids within which segmented nephrons are connected to collecting ducts and surrounded by renal interstitial cells and an endothelial network. As evidence of functional maturity, proximal tubules within organoids display megalin-mediated and cubilin-mediated endocytosis, and they respond to a nephrotoxicant to undergo apoptosis. This protocol consists of 7 d of monolayer culture for intermediate mesoderm induction, followed by 18 d of 3D culture to facilitate self-organizing renogenic events leading to organoid formation. Personnel experienced in culturing hPSCs are required to conduct this protocol.

Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) requires orchestration of dynamic gene regulatory networks during stepwise fate transitions but often generates immature cell types that do not fully recapitulate properties of their adult counterparts, suggesting incomplete activation of key transcriptional networks. We performed extensive single-cell transcriptomic analyses to map fate choices and gene expression programs during cardiac differentiation of hPSCs and identified strategies to improve in vitro cardiomyocyte differentiation. Utilizing genetic gain- and loss-of-function approaches, we found that hypertrophic signaling is not effectively activated during monolayer-based cardiac differentiation, thereby preventing expression of HOPX and its activation of downstream genes that govern late stages of cardiomyocyte maturation. This study therefore provides a key transcriptional roadmap of in vitro cardiac differentiation at single-cell resolution, revealing fundamental mechanisms underlying heart development and differentiation of hPSC-derived cardiomyocytes.

Abstract A variety of experimental and computational methods have been developed to demultiplex samples from pooled individuals in a single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) experiment which either require adding information (such as hashtag barcodes) or measuring information (such as genotypes) prior to pooling. We introduce scSplit which utilises genetic differences inferred from scRNA-Seq data alone to demultiplex pooled samples. scSplit also extracts a minimal set of high confidence presence/absence genotypes in each cluster which can be used to map clusters to original samples. Using a range of simulated, merged individual-sample as well as pooled multi-individual scRNA-Seq datasets, we show that scSplit is highly accurate and concordant with demuxlet predictions. Furthermore, scSplit predictions are highly consistent with the known truth in cell-hashing dataset. We also show that multiplexed-scRNA-Seq can be used to reduce batch effects caused by technical biases. scSplit is ideally suited to samples for which external genome-wide genotype data cannot be obtained (for example non-model organisms), or for which it is impossible to obtain unmixed samples directly, such as mixtures of genetically distinct tumour cells, or mixed infections. scSplit is available at: https://github.com/jon-xu/scSplit

Abstract The discovery that somatic cells can be reprogrammed to induced pluripotent stem cells (iPSCs) - cells that can be differentiated into any cell type of the three germ layers - has provided a foundation for in vitro human disease modelling 1,2 , drug development 1,2 , and population genetics studies 3,4 . In the majority of instances, the expression levels of genes, plays a critical role in contributing to disease risk, or the ability to identify therapeutic targets. However, while the effect of the genetic background of cell lines has been shown to strongly influence gene expression, the effect has not been evaluated at the level of individual cells. Differences in the effect of genetic variation on the gene expression of different cell-types, would provide significant resolution for in vitro research using preprogramed cells. By bringing together single cell RNA sequencing 15–21 and population genetics, we now have a framework in which to evaluate the cell-types specific effects of genetic variation on gene expression. Here, we performed single cell RNA-sequencing on 64,018 fibroblasts from 79 donors and we mapped expression quantitative trait loci (eQTL) at the level of individual cell types. We demonstrate that the large majority of eQTL detected in fibroblasts are specific to an individual sub-type of cells. To address if the allelic effects on gene expression are dynamic across cell reprogramming, we generated scRNA-seq data in 19,967 iPSCs from 31 reprogramed donor lines. We again identify highly cell type specific eQTL in iPSCs, and show that that the eQTL in fibroblasts are almost entirely disappear during reprogramming. This work provides an atlas of how genetic variation influences gene expression across cell subtypes, and provided evidence for patterns of genetic architecture that lead to cell-types specific eQTL effects.

Abstract Heterogeneity of cell states represented in pluripotent cultures have not been described at the transcriptional level. Since gene expression is highly heterogeneous between cells, single-cell RNA sequencing can be used to identify how individual pluripotent cells function. Here, we present results from the analysis of single-cell RNA sequencing data from 18,787 individual WTC CRISPRi human induced pluripotent stem cells. We developed an unsupervised clustering method, and through this identified four subpopulations distinguishable on the basis of their pluripotent state including: a core pluripotent population (48.3%), proliferative (47.8%), early-primed for differentiation (2.8%) and late-primed for differentiation (1.1%). For each subpopulation we were able to identify the genes and pathways that define differences in pluripotent cell states. Our method identified four transcriptionally distinct predictor gene sets comprised of 165 unique genes that denote the specific pluripotency states; and using these sets, we developed a multigenic machine learning prediction method to accurately classify single cells into each of the subpopulations. Compared against a set of established pluripotency markers, our method increases prediction accuracy by 10%, specificity by 20%, and explains a substantially larger proportion of deviance (up to 3-fold) from the prediction model. Finally, we developed an innovative method to predict cells transitioning between subpopulations, and support our conclusions with results from two orthogonal pseudotime trajectory methods.

Abstract The mechanisms by which DNA alleles contribute to disease risk, drug response, and other human phenotypes are highly context-specific, varying across cell types and under different conditions. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are uniquely suited to study these context-dependent effects, but to do so requires cell lines from hundreds or potentially thousands of individuals. Village cultures, where multiple hiPSC lines are cultured and differentiated together in a single dish, provide an elegant solution for scaling hiPSC experiments to the necessary sample sizes required for population-scale studies. Here, we show the utility of village models, demonstrating how cells can be assigned back to a donor line using single cell sequencing, and addressing whether line-specific signaling alters the transcriptional profiles of companion lines in a village culture. We generated single cell RNA sequence data from hiPSC lines cultured independently (uni-culture) and in villages at three independent sites. We show that the transcriptional profiles of hiPSC lines are highly consistent between uni- and village cultures for both fresh (0.46 < R < 0.88) and cryopreserved samples (0.46 < R < 0.62). Using a mixed linear model framework, we estimate that the proportion of transcriptional variation across cells is predominantly due to donor effects, with minimal evidence of variation due to culturing in a village system. We demonstrate that the genetic, epigenetic or hiPSC line-specific effects on gene expression are consistent whether the lines are uni- or village-cultured (0.82 < R < 0.94). Finally, we identify the consistency in the landscape of cell states between uni- and village-culture systems. Collectively, we demonstrate that village methods can be effectively used to detect hiPSC line-specific effects including sensitive dynamics of cell states.

SUMMARY This study develops a versatile cell multiplexing and data analysis platform to gain knowledge gain into mechanisms of cell differentiation. We engineer a cell barcoding system in human cells enabling multiplexed single-cell RNA sequencing for high throughput perturbation of customisable and diverse experimental conditions. This is coupled with a new computational analysis pipeline that overcomes the limitations of conventional algorithms by using an unsupervised, genome-wide, orthogonal biological reference point to reveal the cell diversity and regulatory networks in the input scRNA-seq data set. We implement this pipeline by engineering transcribed barcodes into induced pluripotent stem cells and multiplex 62 independent experimental conditions comprising eight differentiation time points and nine developmental signalling perturbations in duplicates. We identify and deconstruct the temporal, signalling, and gene regulatory imperatives of iPSC differentiation into cell types of ectoderm, mesoderm, and endoderm lineages. This study provides a cellular and computational pipeline to study cell differentiation applicable to studies in developmental biology, drug discovery, and disease modelling.

SUMMARY This study establishes the homeodomain only protein, HOPX, as a determinant controlling the molecular switch between cardiomyocyte progenitor and maturation gene programs. Time-course single-cell gene expression with genome-wide footprinting reveal that HOPX interacts with and controls core cardiac networks by regulating the activity of mutually exclusive developmental gene programs. Upstream hypertrophy and proliferation pathways compete to regulate HOPX transcription. Mitogenic signals override hypertrophic growth signals to suppress HOPX and maintain cardiomyocyte progenitor gene programs. Physiological studies show HOPX directly governs genetic control of cardiomyocyte cell stress responses, electro-mechanical coupling, proliferation, and contractility. We use human genome-wide association studies (GWAS) to show that genetic variation in the HOPX-regulome is significantly associated with complex traits affecting cardiac structure and function. Collectively, this study provides a mechanistic link situating HOPX between competing upstream pathways where HOPX acts as a molecular switch controlling gene regulatory programs underpinning metabolic, signaling, and functional maturation of cardiomyocytes.

Abstract Background Vascular endothelial cells are a mesoderm-derived lineage with many essential functions, including angiogenesis and coagulation. However, the gene regulatory mechanisms that underpin endothelial specialization are largely unknown, as are the roles of 3D chromatin organization in regulating endothelial cell transcription. Methods To investigate the relationships between 3D chromatin organization and gene expression in endothelial cell differentiation, we induced endothelial cell differentiation from human pluripotent stem cells and performed Hi-C and RNA-seq assays at specific timepoints in differentiation. Results Our analyses reveal that long-range intrachromosomal contacts increase over the course of endothelial cell differentiation, as do genomic compartment transitions between active and inactive states. These compartmental states are tightly associated with endothelial transcription. Dynamic topologically associating domain (TAD) boundaries strengthen and converge on an endothelial cell state, and nascent TAD boundaries are linked to the expression of genes that support endothelial cell specification. Relatedly, chromatin pairwise point interactions (DNA loops) increase in frequency during differentiation and are linked to the expression of genes with essential roles in vascular biology, including MECOM, TFPI , and KDR . To identify forms of regulation specific to endothelial cell differentiation, we compared the functional chromatin dynamics of endothelial cells with those of developing cardiomyocytes. Cardiomyocytes exhibit greater long-range cis interactions than endothelial cells, whereas endothelial cells have increased local intra-TAD interactions and much more abundant pairwise point interactions. Conclusions Genome topology changes dynamically during endothelial differentiation, including acquisition of long-range cis interactions and new TAD boundaries, interconversion of hetero- and euchromatin, and formation of DNA loops. These chromatin dynamics guide transcription in the development of endothelial cells and promote the divergence of endothelial cells from related cell types such as cardiomyocytes.