Bacterial colonisation of the intestine has a major role in the post-natal development and maturation of the immune and endocrine systems. These processes are key factors underpinning central nervous system (CNS) signalling. Regulation of the microbiome–gut–brain axis is essential for maintaining homeostasis, including that of the CNS. However, there is a paucity of data pertaining to the influence of microbiome on the serotonergic system. Germ-free (GF) animals represent an effective preclinical tool to investigate such phenomena. Here we show that male GF animals have a significant elevation in the hippocampal concentration of 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxyindoleacetic acid, its main metabolite, compared with conventionally colonised control animals. Moreover, this alteration is sex specific in contrast with the immunological and neuroendocrine effects which are evident in both sexes. Concentrations of tryptophan, the precursor of serotonin, are increased in the plasma of male GF animals, suggesting a humoral route through which the microbiota can influence CNS serotonergic neurotransmission. Interestingly, colonisation of the GF animals post weaning is insufficient to reverse the CNS neurochemical consequences in adulthood of an absent microbiota in early life despite the peripheral availability of tryptophan being restored to baseline values. In addition, reduced anxiety in GF animals is also normalised following restoration of the intestinal microbiota. These results demonstrate that CNS neurotransmission can be profoundly disturbed by the absence of a normal gut microbiota and that this aberrant neurochemical, but not behavioural, profile is resistant to restoration of a normal gut flora in later life.

The gut microbiota interacts with the host via neuroimmune, neuroendocrine and neural pathways. These pathways are components of the brain-gut-microbiota axis and preclinical evidence suggests that the microbiota can recruit this bidirectional communication system to modulate brain development, function and behaviour. The pathophysiology of depression involves neuroimmune-neuroendocrine dysregulation. However, the extent to which changes in gut microbiota composition and function mediate the dysregulation of these pathways is unknown. Thirty four patients with major depression and 33 matched healthy controls were recruited. Cytokines, CRP, Salivary Cortisol and plasma Lipopolysaccharide binding protein were determined by ELISA. Plasma tryptophan and kynurenine were determined by HPLC. Fecal samples were collected for 16s rRNA sequencing. A Fecal Microbiota transplantation was prepared from a sub group of depressed patients and controls and transferred by oral gavage to a microbiota-deficient rat model. We demonstrate that depression is associated with decreased gut microbiota richness and diversity. Fecal microbiota transplantation from depressed patients to microbiota-depleted rats can induce behavioural and physiological features characteristic of depression in the recipient animals, including anhedonia and anxiety-like behaviours, as well as alterations in tryptophan metabolism. This suggests that the gut microbiota may play a causal role in the development of features of depression and may provide a tractable target in the treatment and prevention of this disorder.

Caspase-8 mediates apoptosis induced by 'death receptors' on the cell's surface. At the same time, it is able to prevent receptor interacting protein kinase (RIPK)-dependent necrosis. Without caspase-8, mice die during embryonic development, but why this happens is not clear. Two groups show that this lethality is not caused by the absence of apoptosis, but by the RIPK3-dependent necrosis that is unleashed without caspase-8. Mice lacking both caspase-8 and RIP3 develop into viable, immunocompetent adults, but have a progressive lymphoaccumulative disease similar to that in mice that lack the CD95 death receptor. Oberst et al. also show that caspase-8 forms a proteolytically active complex with FLICE-like inhibitory protein long (FLIPL), and that this complex is required for protection against RIP3-dependent necrosis. Caspase-8 mediates apoptosis induced by death receptors. At the same time, this protease is able to prevent RIP-dependent necrosis. Without caspase-8 mice die during their embryonic development. Two papers now show that lethality is not caused by the absence of apoptosis, but by RIP3-dependent necrosis that is unleashed without caspase-8. Mice that lack both caspase-8 and RIP3 develop into viable, immunocompetent, fertile adult mice, but suffer from a progressive lymphoaccumulative disease similar to mice that lack the death receptor CD95. This paper further shows that caspase-8 forms a proteolytically active complex with FLIPL, and that this complex is required for protection against RIP3-dependent necrosis. Caspase-8 has two opposing biological functions—it promotes cell death by triggering the extrinsic pathway of apoptosis, but also has a survival activity, as it is required for embryonic development1, T-lymphocyte activation2, and resistance to necrosis induced by tumour necrosis factor-α (TNF-α) and related family ligands3,4. Here we show that development of caspase-8-deficient mice is completely rescued by ablation of receptor interacting protein kinase-3 (RIPK3). Adult animals lacking both caspase-8 and RIPK3 display a progressive lymphoaccumulative disease resembling that seen with defects in CD95 or CD95-ligand (also known as FAS and FASLG, respectively), and resist the lethal effects of CD95 ligation in vivo. We have found that caspase-8 prevents RIPK3-dependent necrosis without inducing apoptosis by functioning in a proteolytically active complex with FLICE-like inhibitory protein long (FLIPL, also known as CFLAR), and this complex is required for the protective function.

The recognition and clearance of dead cells is a process that must occur efficiently to prevent an autoimmune or inflammatory response. Recently, a process was identified wherein the autophagy machinery is recruited to pathogen-containing phagosomes, termed MAPLC3A (LC3)-associated phagocytosis (LAP), which results in optimal degradation of the phagocytosed cargo. Here, we describe the engagement of LAP upon uptake of apoptotic, necrotic, and RIPK3-dependent necrotic cells by macrophages. This process is dependent on some members of the classical autophagy pathway, including Beclin1, ATG5, and ATG7. In contrast, ULK1, despite being required for autophagy, is dispensable for LAP induced by uptake of microbes or dead cells. LAP is required for efficient degradation of the engulfed corpse, and in the absence of LAP, engulfment of dead cells results in increased production of proinflammatory cytokines and decreased production of anti-inflammatory cytokines. LAP is triggered by engagement of the TIM4 receptor by either phosphatidylserine (PtdSer)-displaying dead cells or PtdSer-containing liposomes. Therefore, the consequence of phagocytosis of dead cells is strongly affected by those components of the autophagy pathway involved in LAP.

The activation of mixed lineage kinase-like (MLKL) by receptor-interacting protein kinase-3 (RIPK3) results in plasma membrane (PM) disruption and a form of regulated necrosis, called necroptosis. Here, we show that, during necroptosis, MLKL-dependent calcium (Ca2+) influx and phosphatidylserine (PS) exposure on the outer leaflet of the plasma membrane preceded loss of PM integrity. Activation of MLKL results in the generation of broken, PM "bubbles" with exposed PS that are released from the surface of the otherwise intact cell. The ESCRT-III machinery is required for formation of these bubbles and acts to sustain survival of the cell when MLKL activation is limited or reversed. Under conditions of necroptotic cell death, ESCRT-III controls the duration of plasma membrane integrity. As a consequence of the action of ESCRT-III, cells undergoing necroptosis can express chemokines and other regulatory molecules and promote antigenic cross-priming of CD8+ T cells.

The p53 tumor suppressor gene is critically involved in cell cycle regulation, DNA repair, and programmed cell death. Several lines of evidence suggest that p53 death signals lead to caspase activation; however, the mechanism of caspase activation by p53 still is unclear. Expressing wild type p53 by means of an adenoviral expression vector, we were able to induce apoptotic cell death, as characterized by morphological changes, phosphatidylserine externalization, and internucleosomal DNA fragmentation, in p53null Saos-2 cells. This cell death was accompanied by caspase activation as well as by cleavage of caspase substrates and was preceded by mitochondrial cytochrome c release. The addition of the broad-spectrum caspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (zVAD-fmk) directly after transduction almost completely prevented p53-induced apoptotic cell death but did not inhibit mitochondrial cytochrome crelease. In contrast, N-acetylcysteine, even at high concentrations, could not prevent induction of programmed cell death by p53 expression. Cytosolic extracts from Saos-2 cells transduced with p53, but not from Saos-2 cells transduced with the empty adenoviral vector, contained a cytochrome c-releasing activityin vitro, which was still active in the presence of zVAD-fmk. When Bax was immunodepleted from the cytosolic extracts of p53-expressing cells before incubation with isolated mitochondria, thein vitro cytochrome c release was abolished. Thus, we could demonstrate in cells and in vitro that p53 activates the apoptotic machinery through induction of the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space. Furthermore, we provide in vitro evidence for the requirement of cytosolic Bax for this cytochromec-releasing activity of p53 in Saos-2 cells. The p53 tumor suppressor gene is critically involved in cell cycle regulation, DNA repair, and programmed cell death. Several lines of evidence suggest that p53 death signals lead to caspase activation; however, the mechanism of caspase activation by p53 still is unclear. Expressing wild type p53 by means of an adenoviral expression vector, we were able to induce apoptotic cell death, as characterized by morphological changes, phosphatidylserine externalization, and internucleosomal DNA fragmentation, in p53null Saos-2 cells. This cell death was accompanied by caspase activation as well as by cleavage of caspase substrates and was preceded by mitochondrial cytochrome c release. The addition of the broad-spectrum caspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (zVAD-fmk) directly after transduction almost completely prevented p53-induced apoptotic cell death but did not inhibit mitochondrial cytochrome crelease. In contrast, N-acetylcysteine, even at high concentrations, could not prevent induction of programmed cell death by p53 expression. Cytosolic extracts from Saos-2 cells transduced with p53, but not from Saos-2 cells transduced with the empty adenoviral vector, contained a cytochrome c-releasing activityin vitro, which was still active in the presence of zVAD-fmk. When Bax was immunodepleted from the cytosolic extracts of p53-expressing cells before incubation with isolated mitochondria, thein vitro cytochrome c release was abolished. Thus, we could demonstrate in cells and in vitro that p53 activates the apoptotic machinery through induction of the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space. Furthermore, we provide in vitro evidence for the requirement of cytosolic Bax for this cytochromec-releasing activity of p53 in Saos-2 cells. wild type benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp aminofluoromethylcoumarin propidium iodide The p53 tumor suppressor gene is the central integrator of the cellular response to DNA damage, oncogenic transformation, and growth factor withdrawal (1.Levine A.J. Cell. 1997; 88: 323-331Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6759) Google Scholar). The cell cycle regulatory and the DNA repair functions of p53 are largely executed by transactivation of p53-response genes such as p21/WAF1/CIP1 (2.El-Deiry W.S. Tokino T. Velculescu V.E. Levy D.B. Parsons R. Trent J.M. Lin D. Mercer W.E. Kinzler K. Vogelstein B. Cell. 1993; 75: 817-825Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (7957) Google Scholar, 3.Harper J.W. Adami G.R. Wei N. Keyomarsi K. Elledge S.J. Cell. 1993; 75: 805-816Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (5250) Google Scholar, 4.Xiong Y. Hannon G.J. Zhang H. Casso D. Kobayashi R. Beach D. Nature. 1993; 366: 701-704Crossref PubMed Scopus (3179) Google Scholar, 5.Bunz F. Dutriaux A. Lengeauer C. Waldman T. Zhou S. Brown J.P. Sedivy J.M. Kinzler K.W. Vogelstein B. Science. 1998; 282: 1497-1501Crossref PubMed Scopus (2549) Google Scholar) or GADD45 (6.Kastan M.B. Zhan Q. El-Deiry W.S. Carrier F. Jacks T. Walsh W.V. Plunkett B.S. Vogelstein B. Fornace Jr., A.J. Cell. 1992; 71: 587-597Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2931) Google Scholar), thus relying on the ability of p53 to act as a sequence-specific transcription factor. In contrast, the tumor-suppressing activity of p53 does not depend on its transactivational function (7.Crook T. Marston N.J. Sara E.A. Vousden K.H. Cell. 1994; 79: 817-827Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (224) Google Scholar, 8.Unger T. Mietz J.A. Scheffner M. Yee C.L. Howley P.M. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 5186-5194Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar, 9.Zhang Q. Funk W.D. Wright W.E. Shay J.W. Deisseroth A.B. EMBO J. 1994; 13: 2535-2544Crossref PubMed Scopus (125) Google Scholar, 10.Rowan S. Ludwig R.L. Haupt Y. Bates S. Lu X. Oren M. Vousden K.H. EMBO J. 1996; 15: 827-838Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar). It has been shown in several cell types that wild type (wt)1 p53 is required for the apoptotic cell death as induced by γ-irradiation or a variety of anticancer drugs (11.Lowe S.W. Ruley H.E. Jacks T. Housman D.E. Cell. 1993; 74: 957-967Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2963) Google Scholar, 12.Lowe S.W. Schmitt E.M. Smith S.W. Osborne B.A. Jacks T. Nature. 1993; 362: 847-849Crossref PubMed Scopus (2767) Google Scholar). Yet, the pathways whereby p53 leads to execution of the apoptosis program are not well characterized. Possible mechanisms include transcriptional activation of the proapoptotic Bcl-2 family member Bax (13.Miyashita T. Reed J.C. Cell. 1995; 80: 293-299Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (305) Google Scholar, 14.Yin C. Knudson C.M. Korsmeyer S.J. Van Dyke T. Nature. 1997; 385: 637-640Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar), the generation of reactive oxygen species (15.Polyak K. Xia Y. Zweier J.L. Kinzler K.W. Vogelstein B. Nature. 1997; 389: 300-305Crossref PubMed Scopus (2246) Google Scholar), and transcriptional up-regulation of death receptors such as CD95/Fas/APO-1 or DR5/KILLER (16.Owen-Schaub L.B. Zhang W. Cusack J.C. Angelo L.S. Santee S.M. Fujiwara T. Roth J.A. Deisseroth A.B. Zhang W.W. Kruzel E. et al.Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 3032-3040Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar, 17.Bennett M. MacDonald K. Chan S.-W. Luzio J.P. Simari R. Weissberg P. Science. 1998; 282: 290-293Crossref PubMed Scopus (654) Google Scholar, 18.Müller M. Wilder S. Bannasch D. Israeli D. Lehlbach K. Li-Weber M. Friedman S.L. Galle P.R. Oren M. Krammer P.H. J. Exp. Med. 1998; 188: 2033-2045Crossref PubMed Scopus (735) Google Scholar, 19.Sheikh M.S. Burns T.F. Huang Y. Wu G.S. Amundson S. Brooks K.S. Fornace Jr., A.J. El-Deiry W.S. Cancer Res. 1998; 58: 1593-1598PubMed Google Scholar). However, several lines of evidence imply that the proapoptotic activity of p53 is independent of its function as a transcription factor (20.Caelles C. Heimberg A. Karin M. Nature. 1994; 370: 220-223Crossref PubMed Scopus (835) Google Scholar, 21.Haupt Y. Rowan S. Shaulian E. Vousden K.H. Oren M. Genes Dev. 1995; 9: 2170-2183Crossref PubMed Scopus (518) Google Scholar, 22.Haupt Y. Barak Y. Oren M. EMBO J. 1996; 15: 1596-1606Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar). The release of cytochrome c from mitochondria is a central event in the death receptor-independent, "intrinsic," apoptotic pathway (23.Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (702) Google Scholar, 24.Green D.R. Reed J.C. Science. 1998; 281: 1309-1312Crossref PubMed Google Scholar). Cytochrome c together with ATP and Apaf-1 facilitates activation by caspase 9 of the effector caspases (25.Zou H. Henzel W.J. Liu X. Lutschg A. Wang X. Cell. 1997; 90: 405-413Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2746) Google Scholar, 26.Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6261) Google Scholar, 27.Saleh A. Srinivasula S.M. Acharya S. Fishel R. Alnemri E.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17941-17945Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (427) Google Scholar, 28.Hu Y. Benedict M.A. Ding L. Nunez G. EMBO J. 1999; 18: 3586-3595Crossref PubMed Scopus (410) Google Scholar), which then cleave their substrates, finally leading to the apoptotic cell death. Furthermore, cytochrome c release can also occur in death receptor-dependent, "extrinsic," apoptotic pathways by cleavage and activation of the proapoptotic Bcl-2 family member Bid through caspase 8 (29.Luo X. Budihardjo I. Zou H. Slaughter C. Wang X. Cell. 1998; 94: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3085) Google Scholar, 30.Li H. Zhou H. Xu C.-J. Yuan J. Cell. 1998; 94: 491-501Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3798) Google Scholar, 31.Gross A. Yin X.-M. Wang K. Wei M.C. Jockel J. Milliman C. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Korsmeyer S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1156-1163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (932) Google Scholar), possibly serving as an amplification loop. Several studies were undertaken to establish the involvement of caspase activation in p53-mediated cell death (18.Müller M. Wilder S. Bannasch D. Israeli D. Lehlbach K. Li-Weber M. Friedman S.L. Galle P.R. Oren M. Krammer P.H. J. Exp. Med. 1998; 188: 2033-2045Crossref PubMed Scopus (735) Google Scholar,32.Yu Y. Little J.B. Cancer Res. 1998; 5: 4277-4281Google Scholar, 33.Ding H.-F. McGill G. Rowan S. Schmaltz C. Shimamura A. Fisher D.E. J. Biol. Chem. 1998; 273: 28378-28383Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (79) Google Scholar, 34.Fuchs E.J. McKenna K.A. Bedi A. Cancer Res. 1997; 57: 2550-2554PubMed Google Scholar, 35.Henkels K.M. Turchi J.J. Cancer Res. 1999; 59: 3077-3083PubMed Google Scholar). Recently, the requirement of Apaf-1 or caspase 9 for the p53-dependent apoptosis of oncogene-transformed murine embryonic fibroblasts has been conclusively demonstrated (36.Soengas M.S. Alarcón R.M. Yoshida H. Giaccia A.J. Hakem R. Mak T.W. Lowe S.W. Science. 1999; 284: 156-159Crossref PubMed Scopus (596) Google Scholar). The present study was undertaken to address the hypothesis that p53 might induce apoptosis by a death receptor-independent pathway involving the release of mitochondrial cytochrome c. We show in Saos-2 cells that p53 evokes cytochrome c release prior to caspase activation and prior to the occurrence of apoptotic cell membrane changes. Furthermore, we biochemically demonstrate the requirement of cytosolic Bax protein for the cytochromec-releasing activity of p53. Thereby, in our experimental system, we provide a link between p53 and the death receptor-independent activation of the apoptotic machinery downstream of mitochondria. The human osteosarcoma cell line Saos-2 cells was obtained from ATCC (Manassas, VA) and was maintained in McCoy's 5A medium containing 15% fetal calf serum, penicillin, and streptomycin. Antibodies against cytochrome c (clone 7H8.2C12), caspase 3 (polyclonal rabbit antiserum), poly(ADP-ribose) polymerase (clone C2–10), p53 (clones Do-7 and PAb122), p21/WAF1/CIP1 (clone SX118), and Bax (polyclonal rabbit antiserum) were purchased from Pharmingen (San Diego, CA). Polyclonal rabbit antisera against protein kinase C-δ and JNK1 were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), and an antibody against actin (clone C4) was obtained from ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA). A rabbit antiserum against caspase 9 has been described previously (37.Wolf B.B. Goldstein J.C. Stennicke H.R. Beere H. Amarante-Mendes G.P. Salvesen G. Green D.R. Blood. 1999; 94: 1683-1692Crossref PubMed Google Scholar, 38.Stennicke H.R. Jürgensmeier J.M. Shin H. Deveraux Q. Wolf B.B. Yang X. Zhou Q. Ellerby H.M. Ellerby L.M. Bredesen D. Green D.R. Reed J.C. Froelich C.J. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 27084-27090Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (647) Google Scholar). The broad-spectrum caspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (zVAD-fmk) and the fluorochromic caspase substrate benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp aminofluoromethylcoumarin (DEVD-afc) were purchased from Enzyme System Products (Livermore, CA). Replication-deficient adenoviral vectors were generous gifts from Drs. D. C. Maneval and I. Atencio, Canji Inc., San Diego, CA. The vectors either encoded the complete human wt p53 cDNA (Ad.p53) or green fluorescent protein (Ad.GFP) under the control of the cytomegalovirus immediate/early gene promotor (39.Wills K.N. Maneval D.C. Menzel P. Harris M.P. Sutjipto S. Vaillancourt M.-T. Huang W.-M. Johnson D.E. Anderson S.C. Wen S.F. Bookstein R. Shepard H.M. Gregory R.J. Hum. Gene Ther. 1994; 5: 1079-1088Crossref PubMed Scopus (237) Google Scholar, 40.Huyghe B.G. Liu X. Sutjipto S. Sugarman B.J. Horn M.T. Shepard H.M. Scandella C.J. Shabram P. Hum. Gene Ther. 1995; 6: 1403-1416Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). The Ad.GFP vector was applied to determine infectibility and maximal tolerated dose of Saos-2 cells, which was found to be 109 particles/ml. For further experiments, the Ad.p53 vector was used for p53 gene transfer, and the empty adenoviral vector (Ad) served as control. Approximately 18 h before transduction, cells were passaged in 10-cm culture dishes or 12-well plates (Fisher) at a density of 200,000/ml or 50,000/ml, respectively. Vectors were diluted in serum-free medium (Optimem I, Life Technologies, Inc.) at the appropriate dose (109particles/ml). Cells were pulsed with the vectors for 60 min, washed, and supplemented with fresh growth medium containing fetal calf serum. For flow cytometry, cells were harvested by mild trypsinization, followed by washing with growth medium and phosphate-buffered saline. Cell death was determined by two-color analysis of fluorescein isothiocyanate-labeled annexin V (CLONTECH Laboratories) binding and propidium iodide (PI) uptake using a Becton Dickinson FACSCalibur. Cell cycle analysis and quantitation of subdiploid DNA-containing nuclei was performed by detecting PI staining after lysing the cells in HFS (0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100, 50 μg/ml PI) on ice for at least 30 min. Cytosolic extracts were prepared as described previously (41.Bossy-Wetzel E. Newmeyer D.D. Green D.R. EMBO J. 1998; 17: 37-49Crossref PubMed Scopus (1107) Google Scholar, 42.Bossy-Wetzel E. Green D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17484-17490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (286) Google Scholar). In brief, cells were harvested by gently scraping and were incubated in a buffer containing 220 mm mannitol and 60 mm sucrose on ice for 30 min. Then cells were broken in a Dounce homogenizer by 70 gentle strokes of a type B pestle. The homogenates were centrifuged at 16,000 × g for 15 min, and the mitochondria-free supernatants were frozen at −70 °C until further analysis. Extracts of the pellets as well as whole cell extracts were obtained by dissolving in lysis buffer, followed by repetitive vortexing and freeze-thawing. After centrifugation at 16,000 × g, the supernatants were stored at −70 °C. Mitochondria were freshly isolated from the liver of 2-month-old mice as described previously (41.Bossy-Wetzel E. Newmeyer D.D. Green D.R. EMBO J. 1998; 17: 37-49Crossref PubMed Scopus (1107) Google Scholar, 42.Bossy-Wetzel E. Green D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17484-17490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (286) Google Scholar). Aliquots of the mitochondrial preparation were incubated with cytosolic extracts at 37 °C for various time periods. After centrifugation at 20,000 × g for 15 min, the supernatants were analyzed for the presence of cytochrome c by Western blotting. Mitochondrial pellets were resuspended in lysis buffer and were also analyzed by Western blotting. The protein content of cytosolic or whole cell extracts was determined by the Bradford assay (Bio-Rad). For each time point, 25 μg of total protein were boiled in Laemmli buffer for 5 min followed by centrifugation. The supernatants were subjected to electrophoresis in 8% or 15% SDS-polyacrylamide gels using a Bio-Rad minigel apparatus, followed by transfer on nitrocellulose membranes (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech). After blocking with phosphate-buffered saline containing 5% nonfat dry milk and 0.1% Tween 20, the membranes were exposed to the primary antibodies overnight at 4 °C on a shaker. Before and after incubation with the horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (Amersham Pharmacia Biotech), the membranes were washed extensively using phosphate-buffered saline/Tween. Antibody binding was detected by enhanced chemoluminescence (Super Signal; Pierce). Activity of effector caspases was determined in whole cell extracts using the fluorochromic caspase substrate DEVD-afc by means of a SPECTRAFluor (Tecan, Research Triangle Park, NC), as described previously (37.Wolf B.B. Goldstein J.C. Stennicke H.R. Beere H. Amarante-Mendes G.P. Salvesen G. Green D.R. Blood. 1999; 94: 1683-1692Crossref PubMed Google Scholar). In brief, cleavage of DEVD-afc was assessed kinetically at 37 °C every 60 s for 30 min. The enzymatic activity was expressed as the maximal velocity of the resulting fluorescence-time curve. First we assessed whether adenovirus-mediated p53 expression resulted in apoptotic cell death and caspase activation in Saos-2 cells. Transduction with Ad.p53 induced phosphatidylserine externalization as detected by annexin V binding at 24 h followed by membrane disruption, leading to PI uptake starting at 36 h. No such effects were observed upon transduction with the same particle number of the empty Ad vector cassette (Fig.1 A). Similarly, an increase in subdiploid DNA content, indicating internucleosomal DNA fragmentation, was only observed in Saos-2 cells transduced with Ad.p53 but not in Saos-2 cells transduced with Ad (Fig. 1 B). Caspase activity leading to cleavage of DEVD-afc was detected in extracts from Saos-2 cells obtained at 24, 36, and 48 h after transduction with Ad.p53 (Fig.2 A). Immunoblotting demonstrated loss of procaspase 9, cleavage of procaspase 3, and cleavage of the caspase substrates poly(ADP-ribose) polymerase and protein kinase C-δ. Expression of p53 protein as well as induction of the p53 target gene p21/WAF1/CIP1 could be detected as early as 12 h after transduction (Fig. 2 B). Next, testing was conducted to determine if the apoptotic cell death observed after p53 expression in Saos-2 cells was dependent on caspase activity. The addition of the broad spectrum caspase inhibitor zVAD-fmk at a concentration of 100 μm almost completely abrogated cell death (Fig.3 A) and DNA fragmentation (Fig. 3 B), as induced by expression of wt p53 in Saos-2 cells. Several mitochondrial genes potentially generating reactive oxygen species were reported to be induced by p53 overexpression (15.Polyak K. Xia Y. Zweier J.L. Kinzler K.W. Vogelstein B. Nature. 1997; 389: 300-305Crossref PubMed Scopus (2246) Google Scholar), implicating a role of reactive oxygen species as downstream effectors of p53-mediated apoptosis. However, in Saos-2 cells, the addition ofN-acetylcysteine up to concentrations of 10 mmhad no protective effect against p53-induced cell death (Fig.3 A). Moreover, N-acetylcysteine at concentrations of 20 mm or above induced necrotic cell death in Saos-2 cells (data not shown). To assess whether p53 activates caspases by inducing the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space into the cytosol (26.Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6261) Google Scholar, 43.Zou H. Li Y. Liu X. Wang X. J. Biol. Chem. 1999; 274: 11549-11556Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1803) Google Scholar), subcellular fractionation of Saos-2 cells was performed at various time points following transduction with Ad.p53 or with Ad. Cytochrome crelease into the cytosolic fraction of Saos-2 cells could be detected as early as 12 h after transduction with Ad.p53; this corresponded with a depletion of the mitochondria-containing pellet fraction from cytochrome c (Fig.4 A). No such effect could be observed after transduction of Saos-2 cells with vector alone (Fig.4 B). Similar kinetics of mitochondrial cytochromec release were observed after adenoviral expression of wt p53 in the p53null human lung cancer cell line Calu-6 (data not shown). The proapoptotic Bcl-2 family member Bax, which induces mitochondrial cytochrome c release (44.Jürgensmeier J.M. Xie Z. Deveraux Q. Ellerby L. Bredesen D. Reed J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 4997-5002Crossref PubMed Scopus (1375) Google Scholar, 48.Finucane D.M. Bossy-Wetzel E. Waterhouse N.J. Cotter T.G. Green D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2225-2233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (653) Google Scholar), is reported to be transcriptionally activated by p53 in some human cell lines (13.Miyashita T. Reed J.C. Cell. 1995; 80: 293-299Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (305) Google Scholar). In concordance, an increase of Bax protein expression was found in Saos-2 cells following p53 overexpression, but significantly elevated Bax levels were detected only after the onset of cytochrome crelease (Fig. 4 A). Ligation of death receptors such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor receptor 1 also can result in cytochrome c release via activation of caspase 8, followed by cleavage and activation of Bid. Cleaved Bid can then target mitochondria and induce the release of cytochrome c (29.Luo X. Budihardjo I. Zou H. Slaughter C. Wang X. Cell. 1998; 94: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3085) Google Scholar, 30.Li H. Zhou H. Xu C.-J. Yuan J. Cell. 1998; 94: 491-501Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3798) Google Scholar, 31.Gross A. Yin X.-M. Wang K. Wei M.C. Jockel J. Milliman C. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Korsmeyer S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1156-1163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (932) Google Scholar). However, Bid cleavage in death receptor-independent apoptosis as induced by etoposide has been shown to occur downstream of mitochondrial cytochrome c release and was prevented by the caspase inhibitor zVAD-fmk (46.Sun X.-M. McFarlane M. Zhuang J. Wolf B.B. Green D.R. Cohen G.M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 5053-5060Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (780) Google Scholar). To address whether the p53-mediated cytochrome c release observed in our system was dependent on the caspase 8 cleavage of Bid, we again applied the broad spectrum caspase inhibitor zVAD-fmk, which at a concentration of 1 μm is equally potent against effector caspases such as caspases 3 and 7 and against activator caspases such as caspases 8, 9, and 10 in vitro (47.Garcia-Calvo M. Peterson E.P. Leiting B. Ruel R. Nicholson D.W. Thornberry N.A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 32608-32613Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (849) Google Scholar); the addition of 100 μm zVAD-fmk directly after transduction with Ad.p53 did not prevent mitochondrial cytochrome c release (Fig.4 B). Since caspase activity is required for Bid cleavage and activation via the death receptor FADD-caspase 8 pathway, this rules out a role for this pathway in p53-induced cytochrome crelease from mitochondria in Saos-2 cells. To further characterize the mechanism of p53-induced cytochrome c release, cytosolic extracts from Saos-2 cells either transduced with Ad.p53 or with the empty Ad vector were prepared and incubated with freshly isolated murine liver mitochondria. Only extracts from cells expressing wt p53 contained a cytochrome c-releasing activity in vitro, which was not inhibited by addition of zVAD-fmk (Fig.5 A), also ruling out the requirement of caspase activity for the in vitro cytochromec release by p53. When p53 was immunodepleted from the cytosolic extract, the cytochrome c-releasing activity was still retained (Fig. 5 B). This argued against a direct effect of p53 on mitochondria in our in vitro system. As p53 has been described to transactivate the proapoptotic Bcl-2 family member Bax in some cell types (13.Miyashita T. Reed J.C. Cell. 1995; 80: 293-299Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (305) Google Scholar), which was shown to induce cytochrome c release when added to isolated mitochondria (36.Soengas M.S. Alarcón R.M. Yoshida H. Giaccia A.J. Hakem R. Mak T.W. Lowe S.W. Science. 1999; 284: 156-159Crossref PubMed Scopus (596) Google Scholar, 48.Finucane D.M. Bossy-Wetzel E. Waterhouse N.J. Cotter T.G. Green D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2225-2233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (653) Google Scholar), the role of Bax in this in vitro system of p53-mediated cytochrome c release was further investigated. Immunodepletion of Bax, but not of p53 or of the control antigen JNK1, abolished the cytochrome c-releasing activity from the extract of p53 overexpressing cells. (Fig. 5 B). Thus, the cytochrome c-releasing activity of p53 was dependent on the presence of Bax in the cytosol. From current understanding, there are two pathways transducing a death signal to the apoptotic machinery. The "extrinsic" pathway involves trimerization of death receptors such as CD95/Fas/APO-1 or TNF receptor 1 by binding of their respective ligands, which leads to recruitment of the activator caspase 8 via adapter molecules like FADD and TRADD and to its autoactivation (49.Nagata S. Cell. 1997; 88: 355-365Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4561) Google Scholar). Activated caspase 8 either can directly cleave and activate the effector caspases (50.Muzio M. Chinnayan A.M. Kischkel F.C. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J.D. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P.H. Dixit V.M. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2743) Google Scholar, 51.Boldin M.P. Goncharev T.M. Goltsev Y.V. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2113) Google Scholar), or it can cleave Bid to induce the release of mitochondrial cytochromec, which also leads to activation of effector caspases via oligomerization with Apaf-1 and caspase 9 in the presence of ATP (29.Luo X. Budihardjo I. Zou H. Slaughter C. Wang X. Cell. 1998; 94: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3085) Google Scholar, 30.Li H. Zhou H. Xu C.-J. Yuan J. Cell. 1998; 94: 491-501Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3798) Google Scholar, 31.Gross A. Yin X.-M. Wang K. Wei M.C. Jockel J. Milliman C. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Korsmeyer S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1156-1163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (932) Google Scholar). This caspase-dependent activation of the mitochondrial pathway may be important in cells with low concentrations of death receptors or caspase 8 and might act as an amplification loop (42.Bossy-Wetzel E. Green D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17484-17490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (286) Google Scholar). There is evidence for a role of p53 in regulation of membrane expression of some death receptors in several cell types (16.Owen-Schaub L.B. Zhang W. Cusack J.C. Angelo L.S. Santee S.M. Fujiwara T. Roth J.A. Deisseroth A.B. Zhang W.W. Kruzel E. et al.Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 3032-3040Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar, 17.Bennett M. MacDonald K. Chan S.-W. Luzio J.P. Simari R. Weissberg P. Science. 1998; 282: 290-293Crossref PubMed Scopus (654) Google Scholar, 18.Müller M. Wilder S. Bannasch D. Israeli D. Lehlbach K. Li-Weber M. Friedman S.L. Galle P.R. Oren M. Krammer P.H. J. Exp. Med. 1998; 188: 2033-2045Crossref PubMed Scopus (735) Google Scholar, 19.Sheikh M.S. Burns T.F. Huang Y. Wu G.S. Amundson S. Brooks K.S. Fornace Jr., A.J. El-Deiry W.S. Cancer Res. 1998; 58: 1593-1598PubMed Google Scholar). In contrast, the death receptor-independent, intrinsic, apoptotic pathway is directly activated by a death signal, leading to the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space into the cytosol, which then, in the presence of ATP, facilitates oligomerization and activation of Apaf-1 and caspase 9, leading to activation of caspase 3 and other effector caspases (24.Green D.R. Reed J.C. Science. 1998; 281: 1309-1312Crossref PubMed Google Scholar). The release of cytochrome c is regulated by the various pro- and anti-apoptotic members of the Bcl-2 family (23.Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (702) Google Scholar, 44.Jürgensmeier J.M. Xie Z. Deveraux Q. Ellerby L. Bredesen D. Reed J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 4997-5002Crossref PubMed Scopus (1375) Google Scholar, 48.Finucane D.M. Bossy-Wetzel E. Waterhouse N.J. Cotter T.G. Green D.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2225-2233Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (653) Google Scholar, 52.Kluck R.M. Bossy-Wetzel E. Green D.R. Newmeyer D.D. Science. 1997; 275: 1132-1136Crossref PubMed Scopus (4289) Google Scholar, 53.Minn A.J. Kettlun C.S. Liang H. Kelekar A. Vander Heiden M.G. Chang B.S. Fesik S.W. Fill M. Thompson C.B. EMBO J. 1999; 18: 632-643Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar, 54.Deshager S. Osen-Sand A. Nichols A. Eskes R. Montessuit S. Lauper S. Maundrell K. Antonsson B. Martinou J.-C. J. Cell Biol. 1999; 144: 891-901Crossref PubMed Scopus (1093) Google Scholar). Many inducers of apoptosis, such as γ-irradiation, anticancer drugs, staurosporine, and growth factor withdrawal, were shown to activate apoptotic cell death independent of death receptor pathways, thus presumably directly activating this intrinsic apoptotic pathway (34.Fuchs E.J. McKenna K.A. Bedi A. Cancer Res. 1997; 57: 2550-2554PubMed Google Scholar,46.Sun X.-M. McFarlane M. Zhuang J. Wolf B.B. Green D.R. Cohen G.M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 5053-5060Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (780) Google Scholar, 55.Eischen C.M. Kottke T.J. Martins L.M. Basi G.S. Tung J.S. Earnshaw W.C. Leibson P.J. Kaufmann S.H. Blood. 1997; 90: 935-943Crossref PubMed Google Scholar, 56.Wesselborg S. Engels I.H. Rossmann E. Los M. Schulze-Osthoff K. Blood. 1999; 93: 3053-3063Crossref PubMed Google Scholar, 57.del Ruiz-Ruiz M.C. Lopéz-Rivas A. Cell Death Differ. 1999; 6: 271-280Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar). Furthermore, mice deficient in Apaf-1 or caspase 9, which in the intrinsic pathway act downstream of mitochondrial cytochromec release, show severe developmental defects leading to embryonic lethality, and their cells are resistant to death receptor-independent induction of apoptosis by radiation and a variety of anticancer drugs (58.Cecconi F. Alvarez-Bolado G. Meyer B.I. Roth K.A. Gruss P. Cell. 1998; 94: 727-737Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (823) Google Scholar, 59.Yoshida H. Kong Y.-Y. Yoshida R. Elia A.J. Hakem A. Hakem R. Penninger J.M. Mak T.W. Cell. 1998; 94: 739-750Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1004) Google Scholar, 60.Hakem R. Hakem A. Duncan G.S. Henderson J.T. Woo M. Soengas M.S. Elia A. de al Pompa J.L. Kagi D. Khoo W. Potter J. Yoshida R. Kaufman S.A. Lowe S.W. Mak T.W. Cell. 1998; 94: 339-352Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1171) Google Scholar). Whereas the mitochondrial and the downstream events in the intrinsic pathway are well elaborated, the understanding of the events upstream of mitochondria in this pathway is incomplete. A number of studies implies a central role of the p53 tumor suppressor gene in the integration of a death signal to the intrinsic apoptotic pathway (11.Lowe S.W. Ruley H.E. Jacks T. Housman D.E. Cell. 1993; 74: 957-967Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2963) Google Scholar, 12.Lowe S.W. Schmitt E.M. Smith S.W. Osborne B.A. Jacks T. Nature. 1993; 362: 847-849Crossref PubMed Scopus (2767) Google Scholar, 15.Polyak K. Xia Y. Zweier J.L. Kinzler K.W. Vogelstein B. Nature. 1997; 389: 300-305Crossref PubMed Scopus (2246) Google Scholar, 61.McCurrach M.E. Connor T.M.F. Knudson C.M. Korsmeyer S.J. Lowe S.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 2345-2349Crossref PubMed Scopus (354) Google Scholar). Recently, Soengas et al.(36.Soengas M.S. Alarcón R.M. Yoshida H. Giaccia A.J. Hakem R. Mak T.W. Lowe S.W. Science. 1999; 284: 156-159Crossref PubMed Scopus (596) Google Scholar), using murine embryonic fibroblasts, provided evidence that apoptotic cell death as induced by oncogenic transformation requires wt p53 as well as Apaf-1 and caspase 9 (36.Soengas M.S. Alarcón R.M. Yoshida H. Giaccia A.J. Hakem R. Mak T.W. Lowe S.W. Science. 1999; 284: 156-159Crossref PubMed Scopus (596) Google Scholar). Thus, p53 appears to transduce a signal to the apoptotic machinery downstream of mitochondria. However, the link between p53 activation and the postmitochondrial apoptotic machinery still remained to be clarified. We reasoned that p53 might be able to activate effector caspases by inducing the release of mitochondrial cytochrome c into the cytoplasm. To address this hypothesis, we selected the human osteosarcoma cell line Saos-2 based on its p53null status and its ability to undergo cell death upon p53 expression. This allowed us to study whether p53 activation alone may lead to mitochondrial cytochrome c release. An alternative approach could have been to use external triggers of apoptosis, such as anticancer drugs or radiation; however, these might simultaneously initiate several p53-dependent and -independent pathways in cancer cell lines, which could interfere with more detailed analysis of the p53-exclusive pathway. In addition to their p53 deficiency, Saos-2 cells also express a functionally defective, truncated retinoblastoma protein (pRb), which might be one explanation for the absence of a pronounced cell cycle arrest in the G1 phase following expression of wt p53 (data not shown). Thus, it cannot be excluded that the apoptosis of Saos-2 cells, as induced by p53 expression, in part results from the absence of functional pRb. Solely by expressing wt p53 in a p53null background we could induce classical apoptotic cell death in Saos-2 cells, which was prevented by caspase inhibitors. Cell fractionation experiments for the first time provided biochemical evidence for the release of mitochondrial cytochrome c prior to the activation of caspases by p53. Death receptors such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor receptor 1, by caspase 8 cleavage of Bid, can also induce mitochondrial cytochrome c release (29.Luo X. Budihardjo I. Zou H. Slaughter C. Wang X. Cell. 1998; 94: 481-490Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3085) Google Scholar, 30.Li H. Zhou H. Xu C.-J. Yuan J. Cell. 1998; 94: 491-501Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3798) Google Scholar, 31.Gross A. Yin X.-M. Wang K. Wei M.C. Jockel J. Milliman C. Erdjument-Bromage H. Tempst P. Korsmeyer S.J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 1156-1163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (932) Google Scholar). However, in our system the release of cytochrome c as induced by p53 neither in vivo nor in vitro was dependent on caspase activity, thus formally ruling out the involvement of a death receptor pathway. Cleavage and activation of caspase 8 and Bid, which can be observed in response to p53-dependent apoptotic stimuli, therefore must occur downstream of caspase 3 activation via the cytochrome c-Apaf-1-caspase 9 pathway (46.Sun X.-M. McFarlane M. Zhuang J. Wolf B.B. Green D.R. Cohen G.M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 5053-5060Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (780) Google Scholar, 62.Slee E.A. Harte M.T. Kluck R.M. Wolf B.B. Casiano C.A. Newmeyer D.D. Wang H.-G. Reed J.C. Nicholson D.W. Alnemri E.S. Green D.R. Martin S.J. J. Cell Biol. 1999; 114: 281-292Crossref Scopus (1687) Google Scholar). Whereas no evidence was found for a direct effect of p53 itself on isolated mitochondria in vitro, by immunodepletion we could demonstrate the requirement of cytosolic Bax for the cytochromec-releasing activity of p53. Based on our results and the results of others (36.Soengas M.S. Alarcón R.M. Yoshida H. Giaccia A.J. Hakem R. Mak T.W. Lowe S.W. Science. 1999; 284: 156-159Crossref PubMed Scopus (596) Google Scholar), we propose the following model for the induction of apoptosis by p53. Upon activation, p53 induces the release of mitochondrial cytochrome c by a pathway involving cytosolic Bax. Cytosolic cytochrome cfacilitates the activation of caspase 3 and other effector caspases by caspase 9 oligomerization with the adapter molecule Apaf-1 in the presence of ATP. Whether p53 induces cytochrome c release by transcriptionally increasing cytosolic Bax levels, which was observed in some human cell lines (13.Miyashita T. Reed J.C. Cell. 1995; 80: 293-299Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (305) Google Scholar), or whether p53 leads to conformational changes and mitochondrial targeting of Bax by a pathway involving other Bcl-2 family members (54.Deshager S. Osen-Sand A. Nichols A. Eskes R. Montessuit S. Lauper S. Maundrell K. Antonsson B. Martinou J.-C. J. Cell Biol. 1999; 144: 891-901Crossref PubMed Scopus (1093) Google Scholar, 63.Griffiths G.J. Dubrez L. Morgan C.P. Jones N.A. Whitehouse J. Corfe B.M. Dive C. Hickman J.A. J. Cell Biol. 1999; 144: 903-914Crossref PubMed Scopus (394) Google Scholar) or yet unidentified mediators requires further analysis. We thank Dr. B. B. Wolf and all other members of the Division of Cellular Immunology for their help and advice. Drs. D. C. Maneval and I. Atencio, Canji Inc., are thanked for their support and for providing adenoviral vectors.

The gut microbiota is increasingly recognized as an important regulator of host immunity and brain health. The aging process yields dramatic alterations in the microbiota, which is linked to poorer health and frailty in elderly populations. However, there is limited evidence for a mechanistic role of the gut microbiota in brain health and neuroimmunity during aging processes. Therefore, we conducted fecal microbiota transplantation from either young (3–4 months) or old (19–20 months) donor mice into aged recipient mice (19–20 months). Transplant of a microbiota from young donors reversed aging-associated differences in peripheral and brain immunity, as well as the hippocampal metabolome and transcriptome of aging recipient mice. Finally, the young donor-derived microbiota attenuated selective age-associated impairments in cognitive behavior when transplanted into an aged host. Our results reveal that the microbiome may be a suitable therapeutic target to promote healthy aging. The gut microbiome can change with age and influence aging-related diseases systemically, including in the brain. The authors show that rejuvenation of the gut microbiome by fecal microbiota transplantation from young mice reverses aging-induced deficits in the hippocampal immune system, metabolome and transcriptome, and rescues selective cognitive deficits.

Drug-tolerant persister cells (persisters) evade apoptosis upon targeted and conventional cancer therapies and represent a major non-genetic barrier to effective cancer treatment. Here, we show that cells that survive treatment with pro-apoptotic BH3 mimetics display a persister phenotype that includes colonization and metastasis in vivo and increased sensitivity toward ferroptosis by GPX4 inhibition. We found that sublethal mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) and holocytochrome c release are key requirements for the generation of the persister phenotype. The generation of persisters is independent of apoptosome formation and caspase activation, but instead, cytosolic cytochrome c induces the activation of heme-regulated inhibitor (HRI) kinase and engagement of the integrated stress response (ISR) with the consequent synthesis of ATF4, all of which are required for the persister phenotype. Our results reveal that sublethal cytochrome c release couples sublethal MOMP to caspase-independent initiation of an ATF4-dependent, drug-tolerant persister phenotype.

Perturbation of the apoptosis and necroptosis pathways critically influences embryogenesis. Receptor-associated protein kinase-1 (RIPK1) interacts with Fas-associated via death domain (FADD)-caspase-8-cellular Flice-like inhibitory protein long (cFLIPL) to regulate both extrinsic apoptosis and necroptosis. Here, we describe Ripk1-mutant animals (Ripk1R588E [RE]) in which the interaction between FADD and RIPK1 is disrupted, leading to embryonic lethality. This lethality is not prevented by further removal of the kinase activity of Ripk1 (Ripk1R588E K45A [REKA]). Both Ripk1RE and Ripk1REKA animals survive to adulthood upon ablation of Ripk3. While embryonic lethality of Ripk1RE mice is prevented by ablation of the necroptosis effector mixed lineage kinase-like (MLKL), animals succumb to inflammation after birth. In contrast, Mlkl ablation does not prevent the death of Ripk1REKA embryos, but animals reach adulthood when both MLKL and caspase-8 are removed. Ablation of the nucleic acid sensor Zbp1 largely prevents lethality in both Ripk1RE and Ripk1REKA embryos. Thus, the RIPK1-FADD interaction prevents Z-DNA binding protein-1 (ZBP1)-induced, RIPK3-caspase-8-mediated embryonic lethality, affected by the kinase activity of RIPK1.

Mouse knockouts allow studying gene functions. Often, multiple phenotypes are impacted when a gene is inactivated. The International Mouse Phenotyping Consortium (IPMC) has generated thousands of mouse knockouts and catalogued their phenotype data. We have acquired metabolomics data from 220 plasma samples of 30 mouse gene knockouts and corresponding wildtype mice from IMPC. To acquire comprehensive metabolomics data, we have used liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) for detecting polar and lipophilic compounds in an untargeted approach. We have also used targeted methods to measure bile acids, steroids and oxylipins. In addition, we have used gas chromatography GC-TOFMS for measuring primary metabolites. The metabolomics dataset reports 832 unique structurally identified metabolites from 124 chemical classes as determined by ChemRICH software. The GCMS and LCMS raw data files, intermediate and finalized data matrices, R-Scripts, annotation databases and extracted ion chromatograms are provided in this data descriptor. The dataset can be used for subsequent studies to link genetic variants with molecular mechanisms and phenotypes.