Human epidermal Langerhans cells (LCs) can coordinate both immunogenic and tolerogenic immune responses, creating an attractive opportunity for immunomodulation strategies. To investigate transcriptional determinants of human primary LC tolerance we applied single cells RNA-sequencing combined with extensive functional analysis. Unsupervised clustering of single cell transcriptomes indicated that steady-state LC populations exist in a spectrum of immune activation between two states: immunocompetent and immature, distinguishable by high or low CD86 expression, respectively. Suprisingly, LC immunompetency was critical for the efficient induction of regulatory T cells during co-culture assays with naive CD4+ T cells and expansion of autologous memory T cells. Consistently, LC tolerogenic potential was significantly enhanced upon migration from the epidermis. Transcriptional programmes underpinning LC immunocompetency, with increased expression of dendritic cell activation markers (CD83, HLA-DRA and CCR7), were complemented with expression of tolerogenic markers (IDO1, LGALS1 and AHR) in migrated LC. Using protein expression analysis and perturbation with inhibitors, we confirmed the role of IDO1 as a key regulator of LC tolerogenic responses induced during LC migration, identified AHR as a potential component of IDO1-regulatory feedback loop, and demonstrated LC-mediated tolerance can be modulated through treatment with dexamethasone, indicating an opportunity for targeted therapeutic interventions in inflammatory skin disease.

Single-cell transcriptomics has sensitivity limits that restrict low abundance transcript identification, affects clustering and introduce artefact. Here, we describe Constellation DropSeq (C-DropSeq), a molecular transcriptome filter that delivers two orders of magnitude sensitivity gains by maximising read utility while reducing sequencing depth and costs. The simple and powerful method is broadly compatible with library preparation routines and was demonstrated by identifying and characterizing the activation of rare dendritic cell sub-populations.

In silico modelling of biological pathways is a major endeavour of systems biology. Here we present a methodology for construction of pathway models from the literature and other sources using a biologist-friendly graphical modelling system. The pathway notation scheme, called mEPN, is based on the principles of the process diagrams and Petri nets, and facilitates both the graphical representation of complex systems as well as dynamic simulation of their activity. The protocol is divided into four sections: 1) assembly of the pathway in the yEd software package using the mEPN scheme, 2) conversion of the pathway into a computable format, 3) pathway visualisation and in silico simulation using the BioLayout Express3D software, 4) optimisation of model parameterisation. This method allows reconstruction of any metabolic, signalling and transcriptional pathway as a means of knowledge management, as well as supporting the systems level modelling of their dynamic activity.

Langerhans cells (LCs) are a unique population of phagocytes programmed within embryonic skin to maintain tissue and immunological homeostasis at the epidermal barrier site. Unique amongst tissue-resident macrophages, LCs play roles in skin innervation and repair, while also functioning as migrating professional antigen presenting cells, a capability classically assigned to dendritic cells (DC). We currently lack insight into the molecular pathways that determine this dichotomy, when they are established, and whether precursors recruited to the adult skin niche access the same instructive signals laid down in utero. Tracking differentiation of monocyte-derived (m)LCs after destruction of embryo-derived cells in murine adult skin, we reveal intrinsic intra-epidermal heterogeneity and selection of MDP-monocytes to by-pass gene programs specifying a macrophage fate. Within the adult skin, we demonstrate that the hair follicle niche provides Notch signals that determine commitment to become resident mLCs. Using a unique human LC dataset, we show that embryo-derived (e)LCs in newborn human skin retain transcriptional evidence of their macrophage origin, but this is superseded by distinct DC-like immune modules after expansion of the eLC network. Thus, convergent differentiation of monocytes within adult skin replicates conditioning of eLC towards more immunogenic DC-like cells within post-natal skin.

Natural killer (NK) cells are increasingly being recognized as agents for cancer immunotherapy. KIR2DS2 is an activating killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) expressed by NK cells, which has been associated with protective responses to cancer and viral infections. KIR2DS2 binds conserved viral peptides in the context of MHC class I, but to date no cancer-associated peptide ligands that bind activating KIR have been described. In order to determine if targeting KIR was a feasible strategy for mobilizing anti-cancer immune responses we established a peptide-based KIR targeting DNA vaccine. Immunizing KIR-Tg mice with the vaccine construct generated in vivo peptide-specific activation of KIR2DS2-positive NK cells leading to canonical and cross-reactive peptide specific immune responses in vitro. Using immunopeptidomics we identified the nuclear export protein XPO1, which has been associated with poor prognosis in multiple cancers, as providing an HLA-C restricted cancer-associated peptide ligand for KIR2DS2-positive NK cells. DNA vaccination of KIR-Tg mice led to both peptide specific and non-specific tumor cell killing, and protective anti-cancer responses in vivo. We thus show the feasibility of targeting KIR as a strategy that activates NK cells to generate in vivo anti-cancer immune responses, and identify XPO1 as a novel target for NK cells.### Competing Interest StatementUniversity of Southampton (SIK, MDB, PR and RF) have a patent application pending for peptide-based immunotherapy. All other authors declared that no conflict of interests exist.

Abstract The future of single cell diversity screens involves ever-larger sample sizes, dictating the need for higher throughput methods with low analytical noise to accurately describe the nature of the cellular system. Current approaches are limited by the Poisson statistic, requiring dilute cell suspensions and associated losses in throughput. In this contribution, we apply Dean entrainment to both cell and bead inputs, defining different volume packets to effect efficient co-encapsulation. Volume ratio scaling was explored to identify optimal conditions. This enabled the co-encapsulation of single cells with reporter beads at rates of ~1 million cells/hour, while increasing assay signal-to-noise with cell multiplet rates of ~2.5% and capturing ~70% of cells. The method, called Pirouette-seq, extends our capacity to investigate biological systems. TOC Abstract Pirouette-seq involves cell and reporter bead inertial ordering for efficient co-encapsulation, achieving a throughput of 1 million cells/hour, a 2.5% multiplet rate and a 70% cell capture efficiency.

Langerhans cells (LCs) in the epidermis present MHC I and MHC II-restricted antigens thereby priming either CD8 or CD4 T cell immune responses. The genomic programs and transcription factors regulating antigen presentation in LCs remain to be elucidated. We show human LCs are highly efficient in MHC I-antigen cross-presentation but lack the transcription factor IRF8 that is critical in dendritic cells. LC migration from the epidermis enhances their ability to cross-present antigens and is accompanied by the induction of the transcription factor IRF4, whose expression is correlated by scRNA-seq with genes involved in ubiquitin-dependent protein degradation. Chromatin profiling reveals enrichment of EICE and AICE composite DNA binding motifs in regulatory regions of antigen-presentation genes, which can be recognized by IRF4 in conjunction with PU.1 or BATF3 expressed in LCs. Thus, the genomic programming of human LCs including inducible expression of IRF4 with enhanced cross-presentation distinguishes them from conventional dendritic cells.

Langerhans cells (LCs) are distinct among phagocytes, functioning both as embryo-derived, tissue-resident macrophages in skin innervation and repair and as migrating professional antigen-presenting cells, a function classically assigned to dendritic cells (DCs). Here, we demonstrate that both intrinsic and extrinsic factors imprint this dual identity. Using ablation of embryo-derived LCs in the murine adult skin and tracking differentiation of incoming monocyte-derived replacements, we found intrinsic intraepidermal heterogeneity. We observed that ontogenically distinct monocytes give rise to LCs. Within the epidermis, Jagged-dependent activation of Notch signaling, likely within the hair follicle niche, provided an initial site of LC commitment before metabolic adaptation and survival of monocyte-derived LCs. In the human skin, embryo-derived LCs in newborns retained transcriptional evidence of their macrophage origin, but this was superseded by DC-like immune modules after postnatal expansion. Thus, adaptation to adult skin niches replicates conditioning of LC at birth, permitting repair of the embryo-derived LC network.

ABSTRACT The ability to reliably predict and infer cellular responses to environmental exposures would offer a major advance in the investigation of immune regulation in health and disease. One possible approach is the use of in silico modelling. Design of such a mathematical kinetic model would be based on existing knowledge of a biological system and utilise a partial data set to parameterise. However, the process of parameter estimation, key for the accuracy of the model, is difficult to conduct by hand, and thus a computational alternative is necessary. We report the utility of Genetic Algorithm with Rank Selection (GARS) as a parameter estimation tool on multiple biological models, including heat shock, signal transduction via ERK, circadian rhythm and NFκB systems, where it showed strong accuracy and superiority to the Extended Kalman Filter method, Algebraic Difference Equations, and MATLAB fminsearch approaches. GARS parameter estimation is a valuable tool for biological data because it reliably infers system behaviour from partial data sets, allowing for the prediction of cellular responses to environmental exposures.

ABSTRACT Langerhans cells (LCs) reside in the epidermis as a dense network of immune system sentinels, coordinating both immunogenic and tolerogenic immune responses. To determine molecular switches directing induction of LC immune activation, we performed mathematical modelling of gene regulatory networks identified by single cell RNA sequencing of LCs exposed to TNF, a key pro-inflammatory signal produced by the skin. Our approach delineated three programmes of LC phenotypic activation (immunogenic, tolerogenic or ambivalent), and confirmed that TNF enhanced LC immunogenic programming. Through regulon analysis followed by mutual information modelling, we identified IRF1 as the key transcription factor for the regulation of immunogenicity in LCs. Application of a mathematical toggle switch model, coupling IRF1 with tolerance-inducing transcription factors, determined the key set of transcription factors regulating the switch between tolerance and immunogenicity, and correctly predicted LC behaviour in LCs derived from different body sites. Our findings provide a mechanistic explanation of how combinatorial interactions between different transcription factors can coordinate specific transcriptional programmes in human LCs, interpreting the microenvironmental context of the local tissue microenvironments.