In the present study we demonstrate that human monocytes activated by lipopolysaccharides (LPS) were able to produce high levels of interleukin 10 (IL-10), previously designated cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF), in a dose dependent fashion. IL-10 was detectable 7 h after activation of the monocytes and maximal levels of IL-10 production were observed after 24-48 h. These kinetics indicated that the production of IL-10 by human monocytes was relatively late as compared to the production of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8, tumor necrosis factor alpha (TNF alpha), and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), which were all secreted at high levels 4-8 h after activation. The production of IL-10 by LPS activated monocytes was, similar to that of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8, TNF alpha, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), and G-CSF, inhibited by IL-4. Furthermore we demonstrate here that IL-10, added to monocytes, activated by interferon gamma (IFN-gamma), LPS, or combinations of LPS and IFN-gamma at the onset of the cultures, strongly inhibited the production of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8, TNF alpha, GM-CSF, and G-CSF at the transcriptional level. Viral-IL-10, which has similar biological activities on human cells, also inhibited the production of TNF alpha and GM-CSF by monocytes following LPS activation. Activation of monocytes by LPS in the presence of neutralizing anti-IL-10 monoclonal antibodies resulted in the production of higher amounts of cytokines relative to LPS treatment alone, indicating that endogenously produced IL-10 inhibited the production of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8, TNF alpha, GM-CSF, and G-CSF. In addition, IL-10 had autoregulatory effects since it strongly inhibited IL-10 mRNA synthesis in LPS activated monocytes. Furthermore, endogenously produced IL-10 was found to be responsible for the reduction in class II major histocompatibility complex (MHC) expression following activation of monocytes with LPS. Taken together our results indicate that IL-10 has important regulatory effects on immunological and inflammatory responses because of its capacity to downregulate class II MHC expression and to inhibit the production of proinflammatory cytokines by monocytes.

Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 (v-IL-10) strongly reduced antigen-specific proliferation of human T cells and CD4+ T cell clones when monocytes were used as antigen-presenting cells. In contrast, IL-10 and v-IL-10 did not affect the proliferative responses to antigens presented by autologous Epstein-Barr virus-lymphoblastoid cell line (EBV-LCL). Inhibition of antigen-specific T cell responses was associated with downregulation of constitutive, as well as interferon gamma- or IL-4-induced, class II MHC expression on monocytes by IL-10 and v-IL-10, resulting in the reduction in antigen-presenting capacity of these cells. In contrast, IL-10 and v-IL-10 had no effect on class II major histocompatibility complex (MHC) expression on EBV-LCL. The reduced antigen-presenting capacity of monocytes correlated with a decreased capacity to mobilize intracellular Ca2+ in the responder T cell clones. The diminished antigen-presenting capacities of monocytes were not due to inhibitory effects of IL-10 and v-IL-10 on antigen processing, since the proliferative T cell responses to antigenic peptides, which did not require processing, were equally well inhibited. Furthermore, the inhibitory effects of IL-10 and v-IL-10 on antigen-specific proliferative T cell responses could not be neutralized by exogenous IL-2 or IL-4. Although IL-10 and v-IL-10 suppressed IL-1 alpha, IL-1 beta, tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), and IL-6 production by monocytes, it was excluded that these cytokines played a role in antigen-specific T cell proliferation, since normal antigen-specific responses were observed in the presence of neutralizing anti-IL-1, -IL-6, and -TNF-alpha mAbs. Furthermore, addition of saturating concentrations of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, and TNF-alpha to the cultures had no effect on the reduced proliferative T cell responses in the presence of IL-10, or v-IL-10. Collectively, our data indicate that IL-10 and v-IL-10 can completely prevent antigen-specific T cell proliferation by inhibition of the antigen-presenting capacity of monocytes through downregulation of class II MHC antigens on monocytes.

Contact between dendritic cells (DC) and resting T cells is essential to initiate a primary immune response. Here, we demonstrate that ICAM-3 expressed by resting T cells is important in this first contact with DC. We discovered that instead of the common ICAM-3 receptors LFA-1 and alphaDbeta2, a novel DC-specific C-type lectin, DC-SIGN, binds ICAM-3 with high affinity. DC-SIGN, which is abundantly expressed by DC both in vitro and in vivo, mediates transient adhesion with T cells. Since antibodies against DC-SIGN inhibit DC-induced proliferation of resting T cells, our findings predict that DC-SIGN enables T cell receptor engagement by stabilization of the DC-T cell contact zone.

Cell migration through 3D tissue depends on a physicochemical balance between cell deformability and physical tissue constraints. Migration rates are further governed by the capacity to degrade ECM by proteolytic enzymes, particularly matrix metalloproteinases (MMPs), and integrin- and actomyosin-mediated mechanocoupling. Yet, how these parameters cooperate when space is confined remains unclear. Using MMP-degradable collagen lattices or nondegradable substrates of varying porosity, we quantitatively identify the limits of cell migration by physical arrest. MMP-independent migration declined as linear function of pore size and with deformation of the nucleus, with arrest reached at 10% of the nuclear cross section (tumor cells, 7 µm2; T cells, 4 µm2; neutrophils, 2 µm2). Residual migration under space restriction strongly depended upon MMP-dependent ECM cleavage by enlarging matrix pore diameters, and integrin- and actomyosin-dependent force generation, which jointly propelled the nucleus. The limits of interstitial cell migration thus depend upon scaffold porosity and deformation of the nucleus, with pericellular collagenolysis and mechanocoupling as modulators.

The success of cellular therapies will depend in part on accurate delivery of cells to target organs. In dendritic cell therapy, in particular, delivery and subsequent migration of cells to regional lymph nodes is essential for effective stimulation of the immune system. We show here that in vivo magnetic resonance tracking of magnetically labeled cells is feasible in humans for detecting very low numbers of dendritic cells in conjunction with detailed anatomical information. Autologous dendritic cells were labeled with a clinical superparamagnetic iron oxide formulation or 111In-oxine and were co-injected intranodally in melanoma patients under ultrasound guidance. In contrast to scintigraphic imaging, magnetic resonance imaging (MRI) allowed assessment of the accuracy of dendritic cell delivery and of inter- and intra-nodal cell migration patterns. MRI cell tracking using iron oxides appears clinically safe and well suited to monitor cellular therapy in humans.

Recently, we described the cloning and expression of a human cDNA which is the homologue to P600, a gene transcribed by mouse Th2 clones. Based on its activities on human monocytes and B cells this gene was designated IL-13. In the present study we investigated the effects of IL-13 alone or in combination with IL-4, IFN-gamma, or IL-10 on human monocytes. IL-13 induced significant changes in the phenotype of monocytes. Like IL-4, it enhanced the expression of CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD49e (VLA-5), class II MHC, CD13, and CD23, whereas it decreased the expression of CD64, CD32, CD16, and CD14 in a dose-dependent manner. IL-13 induced up-regulation of class II MHC Ag and its down-regulatory effects on CD64, CD32, and CD16 expression were prevented by IL-10. IFN-gamma could also partially prevent the IL-13-induced down-regulation of CD64, but not that of CD32 and CD16. However, IL-13 strongly inhibited spontaneous and IL-10- or IFN-gamma-induced ADCC activity of human monocytes toward anti-D coated Rh+ erythrocytes, indicating that the cytotoxic activity of monocytes was inhibited. Furthermore, IL-13 inhibited production of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 p35, IL-12 p40, macrophage inflammatory protein-1 alpha, granulocyte/macrophage-CSF, granulocyte-CSF, IFN-alpha, and TNF alpha by monocytes activated with LPS. In contrast, IL-13 enhanced the production of IL-1 ra by these cells. Similar results on cytokine production were observed or have been obtained with IL-4. Thus IL-13 shares most of its activities on human monocytes with IL-4, but no additive or synergistic effects of IL-4 and IL-13 on human monocytes were observed, suggesting that these cytokines may share common receptor components. Taken together, these results indicate that IL-13 has anti-inflammatory and important immunoregulatory activities.

Abstract Dendritic cells (DCs) capture Ags or viruses in peripheral tissue to transport them to lymphoid organs to induce cellular T cell responses. Recently, a DC-specific C-type lectin was identified, DC-specific ICAM-grabbing non-integrin (DC-SIGN), that functions as cell adhesion receptor mediating both DC migration and T cell activation. DC-SIGN also functions as an HIV-1R that captures HIVgp120 and facilitates DC-induced HIV transmission of T cells. Internalization motifs in the cytoplasmic tail of DC-SIGN hint to a function of DC-SIGN as endocytic receptor. In this study we demonstrate that on DCs DC-SIGN is rapidly internalized upon binding of soluble ligand. Mutating a putative internalization motif in the cytoplasmic tail reduces ligand-induced internalization. Detailed analysis using ratio fluorescence imaging and electron microscopy showed that DC-SIGN-ligand complexes are targeted to late endosomes/lysosomes. Moreover, ligands internalized by DC-SIGN are efficiently processed and presented to CD4+ T cells. The distinct pattern of expression of C-type lectins on DCs in situ and their nonoverlapping Ag recognition profile hint to selective functions of these receptors to allow a DC to recognize a wide variety of Ags and to process these to induce T cell activation. These data point to a novel function of the adhesion receptor DC-SIGN as an efficient DC-specific Ag receptor that can be used as a target to induce viral and antitumor immunity.

We recently isolated a cDNA clone that encodes the melanocyte lineage-specific antigen glycoprotein (gp)100. Antibodies directed against gp100 are an important tool in the diagnosis of human melanoma. Since the gp100 antigen is highly expressed in melanocytic cells, we investigated whether this antigen might serve as a target for antimelanoma cytotoxic T lymphocytes (CTL). Here, we demonstrate that cytotoxic tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) derived from a melanoma patient (TIL 1200) are directed against gp100. HLA-A2.1+ melanoma cells are lysed by TIL from this patient. In addition, murine double transfectants, expressing both HLA-A2.1 and gp100, are lysed by TIL 1200, whereas transfectants expressing only HLA-A2.1 are not susceptible to lysis. Furthermore, the HLA-A2.1+ melanoma cell line BLM, which lacks gp100 expression and is resistant to lysis, becomes susceptible after transfection of gp100 cDNA. Finally, HLA-A2.1+ normal melanocytes are lysed by TIL 1200. These data demonstrate that the melanocyte differentiation antigen gp100 can be recognized in the context of HLA-A2.1 by CTL from a melanoma patient. Gp100 may therefore constitute a useful target for specific immunotherapy against melanoma, provided that no unacceptable cytotoxicity towards normal tissue is observed.

Dendritic cells form a system of highly efficient antigen-presenting cells. After capturing antigen in the periphery, they migrate to lymphoid organs where they present the antigen to T cells. Their seemingly unique ability to interact with and sensitize naive T cells gives dendritic cells a central role in the initiation of immune responses and allows them to be used in therapeutic strategies against cancer, viral infection and other diseases. How they interact preferentially with naive rather than activated T lymphocytes is still poorly understood. Chemokines direct the transport of white blood cells in immune surveillance. Here we report the identification and characterization of a C-C chemokine (DC-CK1) that is specifically expressed by human dendritic cells at high levels. Tissue distribution analysis demonstrates that dendritic cells present in germinal centres and T-cell areas of secondary lymphoid organs express this chemokine. We show that DC-CK1, in contrast to RANTES, MIP-1alpha and interleukin-8, preferentially attracts naive T cells (CD45RA+). The specific expression of DC-CK1 by dendritic cells at the site of initiation of an immune response, combined with its chemotactic activity for naive T cells, suggests that DC-CK1 has an important rule in the induction of immune responses.