Abstract In diploid cells, maternal and paternal copies of genes usually have similar transcriptional activity. Mammalian allele-specific epigenetic mechanisms such as X-chromosome inactivation (XCI) and imprinting were historically viewed as rare exceptions to this rule. The discovery of mitotically stable monoallelic autosomal expression (MAE) a decade ago revealed an additional allele-specific mode regulating thousands of mammalian genes. However, despite its prevalence, the mechanistic basis of MAE remains unknown. To uncover the mechanism of MAE maintenance, we devised a small-molecule screen for reactivation of silenced alleles across multiple loci using targeted RNA sequencing. Contrary to previous reports, we identified DNA methylation as a key mechanism of MAE mitotic maintenance. In contrast with the binary choice of the active allele in XCI, stringent transcriptome-wide analysis revealed MAE as a regulatory mode with tunable control of allele-specific expression, dependent on the extent of DNA methylation. In a subset of MAE genes, allelic imbalance was insensitive to changes in DNA methylation, implicating additional mechanisms in MAE maintenance in these loci. Our findings identify a key mechanism of MAE maintenance, reveal tunability of this mode of gene regulation, and provide the essential platform for probing the biological role of MAE in development and disease.

RNA sequencing and other experimental methods that produce large amounts of data are increasingly dominant in molecular biology. However, the noise properties of these techniques have not been fully understood. We assessed the reproducibility of allele-specific expression measurements by conducting replicate sequencing experiments from the same RNA sample. Surprisingly, variation in the estimates of allelic imbalance (AI) between technical replicates was up to 7-fold higher than expected from commonly applied noise models. We show that AI overdispersion varies substantially between replicates and between experimental series, appears to arise during the construction of sequencing libraries, and can be measured by comparing technical replicates. We demonstrate that compensation for AI overdispersion greatly reduces technical variation and enables reliable differential analysis of allele-specific expression across samples and across experiments. Conversely, not taking AI overdispersion into account can lead to a substantial number of false positives in analysis of allele-specific gene expression

Studying the molecular consequences of rare genetic variants has the potential of identifying novel and hereto uncharacterized pathways causally contributing to phenotypic variation. Here we characterize the functional consequences of a rare coding variant of TAO3, previously reported to significantly contribute to sporulation efficiency variation in Saccharomyces cerevisiae. During mitosis TAO3 interacts with CBK1, a conserved NDR kinase and a component of RAM network. The RAM network genes are involved in regulation cell separation and polarization. We demonstrate that the role of the rare allele TAO3(4477C) in meiosis is distinct from its role in mitosis by being independent of ACE2, which is a RAM network target gene. By quantitatively measuring cell morphological dynamics and conditionally expressing TAO3(4477C) allele during sporulation, we show that TAO3 has an early role in meiosis. This early role of TAO3 coincides with entry of cells into meiotic division. Time-resolved transcriptome analyses during early sporulation phase identified regulators of carbon and lipid metabolic pathways as candidate mediators. We experimentally show that during sporulation the TAO3 allele genetically interacts with ERT1 and PIP2, the regulators of tricarboxylic acid cycle and gluconeogenic enzymes, respectively. We thus uncover meiotic functions of TAO3, a mitotic gene and propose ERT1 and PIP2 as novel regulators of sporulation efficiency. Our results demonstrate that study of causal effects of genetic variation on the underlying molecular network has the potential to provide more extensive comprehension of the pathways driving a complex trait. This can help identify prospective personalized targets for intervention in complex diseases.

Integrating network theory approaches over longitudinal genome-wide gene expression data is a robust approach to understand the molecular underpinnings of a dynamic biological process. Here, we performed a network-based investigation of longitudinal gene expression changes during sporulation of a yeast strain, SK1. Using global network attributes, viz. clustering coefficient, degree distribution of a node, degree-degree mixing of the connected nodes and disassortativity, we observed dynamic changes in these parameters indicating a highly connected network with inter-module crosstalk. Analysis of local attributes, such as clustering coefficient, hierarchy, betweenness centrality and Granovetter's weak ties showed that there was an inherent hierarchy under regulatory control that was determined by specific nodes. Biological annotation of these nodes indicated the role of specifically linked pairs of genes in meiosis. These genes act as crucial regulators of sporulation in the highly sporulating SK1 strain. An independent analysis of these network properties in a less efficient sporulating strain helped to understand the heterogeneity of network profiles. We show that comparison of network properties has the potential to identify candidate nodes contributing to the phenotypic diversity of developmental processes in natural populations. Therefore, studying these network parameters as described in this work for dynamic developmental processes, such as sporulation in yeast and eventually in disease progression in humans, can help in identifying candidate factors which are potential regulators of differences between normal and perturbed processes and can be causal targets for intervention.

Analysis of allele-specific expression is strongly affected by the technical noise present in RNA-seq experiments. Previously, we showed that technical replicates can be used for precise estimates of this noise, and we provided a tool for correction of technical noise in allele-specific expression analysis. This approach is very accurate but costly due to the need for two or more replicates of each library. Here, we develop a spike-in approach that is highly accurate at only a small fraction of the cost.We show that a distinct RNA added as a spike-in before library preparation reflects technical noise of the whole library and can be used in large batches of samples. We experimentally demonstrate the effectiveness of this approach using combinations of RNA from species distinguishable by alignment, namely, mouse, human, and C.elegans . Our new approach, controlFreq , enables highly accurate and computationally efficient analysis of allele-specific expression in (and between) arbitrarily large studies at an overall cost increase of ~ 5%.Analysis pipeline for this approach is available at GitHub as R package controlFreq ( github.com/gimelbrantlab/controlFreq ).agimelbrant@altius.org.

ABSTRACT The persistence of patterns of monoallelic expression is a controversial matter. We report a genome-wide in vivo transcriptomics approach based on allelic expression imbalance to evaluate whether the transcriptional allelic patterns of single murine hematopoietic stem cells (HSC) are still present in the respective differentiated clonal B-cell populations. For 14 genes, we show conclusive evidence for a remarkable persistence in HSC-derived B clonal cells of allele-specific autosomal transcriptional states already present in HSCs. In a striking contrast to the frequency of genes with clonal allelic expression differences in clones expanded without differentiation (up to 10%), we find that clones that have undergone multiple differentiation steps in vivo are more similar to each other. These data suggest that most of the random allele-specific stable transcriptional states on autosomal chromosomes are established de novo during cell lineage differentiation. Given that allele-specific transcriptional states are more stable in cells not undergoing extensive differentiation than in the clones we assessed after full lineage differentiation in vivo , we introduce the “ Punctuated Disequilibria” model: random allelic expression biases are stable if the cells are not undergoing differentiation, but may change during differentiation between developmental stages and reach a new stable equilibrium that will only be challenged if the cell engages in further differentiation. Thus, the transcriptional allelic states may not be a stable feature of the differentiating clone, but phenotypic diversity between clones of a population at any given stage of the cell lineage is still ensured.