Abstract Metabarcoding of Metazoa using mitochondrial genes may be confounded by both the accumulation of PCR and sequencing artefacts and the co-amplification of nuclear mitochondrial pseudogenes (NUMTs). The application of read abundance thresholds and denoising methods is efficient in reducing noise accompanying authentic mitochondrial amplicon sequence variants (ASVs). However, these procedures do not fully account for the complex nature of concomitant sequences and the highly variable DNA contribution of individuals in a metabarcoding sample. We propose, as a complement to denoising, the metabarcoding Multidimensional Abundance Threshold Evaluation ( metaMATE ) framework, a novel approach that allows comprehensive examination of multiple dimensions of abundance filtering and the evaluation of the prevalence of unwanted concomitant sequences in denoised metabarcoding datasets. metaMATE requires a denoised set of ASVs as input, and designates a subset of ASVs as being either authentic (mtDNA haplotypes) or non-authentic ASVs (NUMTs and erroneous sequences) by comparison to external reference data and by analysing nucleotide substitution patterns. metaMATE (i) facilitates the application of read abundance filtering strategies, which are structured with regard to sequence library and phylogeny and applied for a range of increasing abundance threshold values, and (ii) evaluates their performance by quantifying the prevalence of non-authentic ASVs and the collateral effects on the removal of authentic ASVs. The output from metaMATE facilitates decision-making about required filtering stringency and can be used to improve the reliability of intraspecific genetic information derived from metabarcode data. The framework is implemented in the metaMATE software, available at https://github.com/tjcreedy/metamate ).

ABSTRACT Soil mesofauna communities are hyperdiverse and critical for ecosystem functioning. However, our knowledge on spatial structure and underlying processes of community assembly for soil arthropods is scarce, hampered by limited empirical data on species diversity and turnover. We implement a high-throughput-sequencing approach to generate comparative data for thousands of arthropods at three hierarchical levels: genetic, species and supra-specific lineages. A joint analysis of the spatial arrangement across these levels can reveal the predominant processes driving the variation in biological assemblages at the local scale. This multi-hierarchical approach was performed using haplotype-level-COI metabarcoding of entire communities of mites, springtails and beetles from three Iberian mountain regions. Tens of thousands of specimens were extracted from deep and superficial soil layers and produced comparative phylogeographic data for >1000 co-distributed species and nearly 3000 haplotypes. Local assemblages were highly distinctive between grasslands and forests, and within each of them showed strong spatial structures and high endemicity at the scale of a few kilometres or less. The local distance-decay patterns were self-similar for the haplotypes and higher hierarchical entities, and this fractal structure was very similar in all three regions, pointing to a significant role of dispersal limitation driving the local-scale community assembly. Our results from whole-community metabarcoding provide unprecedented insight into how dispersal limitations constrain mesofauna community structure within local spatial settings over evolutionary timescales. If generalized across wider areas, the high turnover and endemicity in the soil locally may indicate extremely high richness globally, challenging our current estimations of total arthropod-diversity on Earth.