Pluripotent embryonic stem cells (ESC, ES cells) of line D3 were differentiated in vitro via embryo-like aggregates (embryoid bodies) of defined cell number into spontaneously beating cardiomyocytes. By using RT-PCR technique, α- and β-cardiac myosin heavy chain (MHC) genes were found to be expressed in embryoid bodies of early to terminal differentiation stages. The exclusive expression of the β-cardiac MHC gene detected in very early differentiated embryoid bodies proved to be dependent on the number of ES cells developing in the embryoid body. Cardiomyocytes enzymatically isolated from embryoid body outgrowths at different stages of development were further characterized by immunocytological and electrophysiological techniques. All cardiomyocytes appeared to be positive in immunofluorescence assays with monoclonal antibodies against cardiac-specific α-cardiac MHC, as well as muscle-specific sarcomeric myosin heavy chain and desmin. The patch-clamp technique allowed a more detailed characterization of the in vitro differentiated cardiomyocytes which were found to represent phenotypes corresponding to sinusnode, atrium or ventricle of the heart. The cardiac cells of early differentiated stage expressed pacemaker-like action potentials similar to those described for embryonic cardiomyocytes. The action potentials of terminally differentiated cells revealed shapes, pharmacological characteristics and hormonal regulation inherent to adult sinusnodal, atrial or ventricular cells. In cardiomyocytes of intermediate differentiation state, action potentials of very long duration (0.3–1 s) were found, which may represent developmentally controlled transitions between different types of action potentials. Therefore, the presented ES cell differentiation system permits the investigation of commitment and differentiation of embryonic cells into the cardiomyogenic lineage in vitro.

Cardiomyocytes differentiated in vitro from pluripotent embryonic stem (ES) cells of line D3 via embryo-like aggregates (embryoid bodies) were characterized by the whole-cell patch-clamp technique during the entire differentiation period. Spontaneously contracting cardiomyocytes were enzymatically isolated by collagenase from embryoid body outgrowths of early, intermediate, and terminal differentiation stages. The early differentiated cardiomyocytes exhibited an outwardly rectifying, transient K+ current sensitive to 4-aminopyridine and an inward Ca2+ current but no Na+ current. The Ca2+ current showed all features of L-type Ca2+ current, being highly sensitive to 1,4-dihydropyridines but not to omega-conotoxin. Cardiomyocytes of intermediate stage were characterized by the additional expression of cardiac-specific Na+ current, the delayed K+ current, and If current. Terminally differentiated cardiomyocytes expressed a Ca2+ channel density about three times higher than that of early stage. In addition, two types of inwardly rectifying K+ currents (IK1 and IK,Ach) and the ATP-modulated K+ current were found. During cardiomyocyte differentiation, several distinct cell populations could be distinguished by their sets of ionic channels and typical action potentials presumably representing cardiac tissues with properties of sinus node, atrium, and ventricle. Reverse transcription polymerase chain reaction revealed the transcription of alpha- and beta-cardiac myosin heavy chain (MHC) genes synchronously with the first spontaneous contractions. Transcription of embryonic skeletal MHC gene at intermediate and terminal differentiation stages correlated with the expression of Na+ channels. The selective expression of alpha-cardiac MHC gene in ES cell-derived cardiomyocytes was demonstrated after ES cell transfection of the LacZ construct driven by the alpha-cardiac MHC promoter region followed by ES cell differentiation and beta-galactosidase staining. In conclusion, our data demonstrate that ES cell-derived cardiomyocytes represent a unique model to investigate the early cardiac development and permit pharmacological/toxicological studies in vitro.

The mouse blastocyst-derived embryonic stem cell (ES cell) line BLC6 efficiently differentiates into myosin heavy chain-, desmin- and myogenin-positive skeletal muscle cells when cultivated in embryo-like aggregates (embryoid bodies). Here, we show that the muscle-specific determination genes myf5, myogenin, myoD, and myf6 are expressed in these embryoid bodies in a characteristic temporal pattern which precisely reflects the sequence observed during mouse development in vivo. Myf5 is the first gene to be expressed followed by myogenin, myoD, and myf6, in this order. In situ hybridization demonstrates transcripts for myogenin and myoD accumulating in mono- and multinucleated myogenic cells, while myf5 mRNA is already found in mononucleated myoblasts. The myocytes also express functional nicotinic cholinoceptors and exhibit T-type Ca2+ currents and later L-type Ca2+ currents, demonstrating physiological properties of skeletal muscle cells. During myocyte differentiation the density of L-type Ca2+ channels significantly increases while the density of T-type Ca2+ channels decreases. The effect of external signals on myogenic differentiation of BLC6 cells was demonstrated by cocultivation with visceral endodermal END-2 cells and the activin A-secreting WEHI-3 cells. END-2 cells essentially prevent skeletal muscle differentiation, whereas basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-β, and WEHI-3 cells have no or an attenuating effect, respectively. Our results suggest that ES cells recapitulate closely the early steps of muscle development in vivo and may serve as an excellent in vitro system to study this process.

Abstract Ca 2+ and V m transitions occurring throughout AP cycles in sinoatrial nodal (SAN) cells are cues that: (1) not only regulate activation states of molecules operating within criticality (Ca 2+ domain) and limit-cycle (V m domain) mechanisms of a coupled-clock system that underlies SAN cell automaticity; (2) but are also regulated by the activation states of the clock molecules they regulate. In other terms, these cues are both causes and effects of clock molecular activation (recursion). Recently, we demonstrated that Ca 2+ and V m transitions during AP cycles in single SAN cells isolated from mice, guinea pigs, rabbits and humans are self-similar (obey a power law) and are also self-similar to trans-species AP firing intervals of these cells in vitro , to heart rate in vivo , and to body mass. Neurotransmitter stimulation of β adrenergic receptor or cholinergic receptor initiated signaling in SAN cells modulates their AP firing rate and rhythm by impacting on the degree to which SAN clocks couple to each other, creating the broad physiologic range of SAN cell mean AP firing intervals and firing interval variabilities. Here we show that Ca 2+ and V m domain kinetic transitions (time to AP ignition in diastole and 90% AP recovery) occurring within given AP, the mean AP firing intervals, and AP firing interval variabilities within time-series of APs in 230 individual SAN cells are self-similar (obey power laws). In other terms, these long-range correlations inform on self-similar distributions of order among SAN cells across the entire broad physiologic range of SAN AP firing intervals, regardless of whether autonomic receptors of these cells are stimulated or not, and regardless of the type (adrenergic or cholinergic) of autonomic receptor stimulation. These long-range correlations among distributions of Ca 2+ and V m kinetic functions that regulate SAN cell clock coupling during each AP cycle in different individual , isolated SAN cells not in contact with each other. Our numerical model simulations further extended our perspectives to the molecular scale and demonstrated that many ion currents also behave self-similar across autonomic states. Thus, to ensure rapid flexibility of AP firing rates in response to different types and degrees of autonomic input, nature “did not reinvent molecular wheels within the coupled-clock system of pacemaker cells”, but differentially engaged or scaled the kinetics of gears that regulate the rate and rhythm at which the “wheels spin” in a given autonomic input context.

Abstract Background Translation of knowledge of sinoatrial nodal “SAN” automaticity gleaned from animal studies to human dysrhythmias, e.g. “Sick Sinus” Syndrome (SSS) requiring electronic pacemaker insertion has been sub-optimal, largely because heart rate (HR) varies widely across species. Objectives To discover regulatory universal mechanisms of normal automaticity in SAN pacemaker cells that are self-similar across species. Method Sub-cellular Ca 2+ releases, whole cell AP-induced Ca 2+ transients and APs were recorded in isolated mouse, guinea-pig, rabbit and human SAN cells. Parametric Ca 2+ and Vm Kinetic Transitions (PCVKT) during phases of AP cycles from their ignition to recovery were quantified. Results Although both action potential cycle lengths (APCL) and PCVKT during AP cycles differed across species by ten-fold, trans-species scaling of PCVKT during AP cycles and scaling, of PCVKT to APCL in cells in vitro , EKG RR intervals in vivo , and BM were self-similar (obeyed power laws) across species. Thus, APCL in vitro , HR in vivo , and BM of any species can be predicted by PCVKT during AP cycles in SAN cells measured in any single species in vitro . Conclusions In designing optimal HR to match widely different BM and energy requirements from mice to humans, nature did not “reinvent pacemaker cell wheels”, but differentially scaled kinetics of gears that regulate the rates at which the “wheels spin”. This discovery will facilitate the development of novel pharmalogic therapies and biologic pacemakers featuring a normal, wide-range rate regulation in animal models and the translation of these to humans to target recalcitrant human SSS. Condensed Abstract Studies in animal models are an important facet of cardiac arrhythmia research. Because HR differs by over ten-fold between some animals and humans, translation of knowledge about regulatory mechanisms of SAN normal automaticity gleaned from studies in animal models to target human SSS has been sub-optimal. Our findings demonstrating that trans-species self-similarity of sub-cellular and cellular mechanisms that couple Ca 2+ to Vm during AP cycles can predict heart rate in vivo from mice to humans will inform on the design of novel studies in animal models and facilitate translation of this knowledge to target human disease.

Abstract The heartbeat is initiated by pacemaker cells residing in the sinoatrial node (SAN). SAN cells generate spontaneous action potentials (APs), i.e. normal automaticity. The sympathetic nervous system increases heart rate commensurate with cardiac output demand via stimulation of SAN β-adrenergic receptors (βAR). While SAN cells reportedly represent a highly heterogeneous cell population, the current dogma is that in response to βAR stimulation all cells increase their spontaneous AP firing rate in a similar fashion. The aim of the present study was to investigate cell-to-cell variability in the responses of a large population of SAN cells. We measured βAR responses among 166 single SAN cells isolated from 33 guinea pig hearts. In contrast to the current dogma, the SAN cell responses to βAR stimulation substantially varied. In each cell, changes in AP cycle length highly correlated (R 2 =0.97) with the AP cycle length before βAR stimulation. While, as expected, on average the cells increased their pacemaker rate, greater responses were observed in cells with slower basal rates, and vice versa, cells with higher basal rates showed smaller responses, no responses, or even decreased their rate. Thus, βAR stimulation synchronizes the operation of the SAN cell population towards a higher average rate, rather than uniformly shifting the rate in each cell, creating a new paradigm of βAR-driven fight-or-flight response among individual pacemaker cells.

ABSTRACT Each heartbeat is initiated by specialized pacemaker cells operating within the sinoatrial node (SAN). While individual cells within SAN tissue exhibit substantial heterogeneity of their electrophysiological parameters and Ca cycling, the role of this heterogeneity for cardiac pacemaker function remains mainly unknown. Here we investigated the problem numerically in a 25×25 square grid of coupled-clock Maltsev-Lakatta cell models and tested the hypothesis that functional heterogeneity of cell populations increases robustness of SAN function. The tissue models were populated by cells with different degree of heterogeneity of the two key model parameters of the coupled-clock system, maximum L-type Ca current conductance ( g CaL ) and sarcoplasmic reticulum Ca pumping rate ( P up ). Our simulations showed that in the areas of P up -g CaL parametric space at the edge of the system stability where action potential (AP) firing was absent or dysrhythmic in tissues populated by identical cells, rhythmic AP generation was rescued in tissues populated by cells with uniformly random distributions of g CaL or P up (but keeping the same average values). This effect to increase robust AP generation was synergistic with respect to heterogeneity in both g CaL and P up and was further strengthened by clustering of cells with higher g CaL or P up . The effect of functional heterogeneity was not due to a simple summation of activity of intrinsically firing cells naturally present in SAN; rather AP firing cells locally and critically interacted with non-firing/dormant cells. When firing cells prevailed, they recruited many dormant cells to fire, strongly enhancing overall SAN function. And vice versa, prevailing dormant cells suppressed AP firing in cells with intrinsic automaticity and halted SAN automaticity.

A bstract The spontaneous action potential (AP) firing rate of sinoatrial nodal cells (SANC) is regulated by a system of intracellular Ca 2+ and membrane ion current clocks driven by Ca 2+ -calmodulin-activated adenylyl cyclase-protein kinase A (PKA) signaling. The mean AP cycle length (APCL) and APCL variability inform on the effectiveness of clock coupling. Endogenous ATP metabolite adenosine (ado) binds to adenosine receptors that couple to G i protein-coupled receptors, reducing spontaneous AP firing rate via G βγ signaling that activates an membrane-clock outward current, I KACh . Ado also inhibits adenylyl cyclase activity via G iα signaling, impacting cAMP-mediated PKA-dependent protein phosphorylation and intracellular Ca 2+ cycling. We hypothesize that in addition to I KAdo activation, ado signaling impacts Ca 2+ via G iα signaling and that both effects reduce AP firing rate by reducing the effectiveness of the Ca 2+ and membrane clock coupling. To this end, we measured Ca 2+ and membrane potential characteristics in enzymatically isolated single rabbit SANC. 10 µM ado substantially increased both the mean APCL (on average by 43%, n=10) and AP beat-to-beat variability from 5.1±1.7% to 7.2±2.0% (n=10) measured via membrane potential and 5.0±2.2 to 10.6±5.9 (n=40) measured via Ca 2+ (assessed as the coefficient of variability, CV=SD/mean). These effects were mediated by hyperpolarization of the maximum diastolic membrane potential (membrane clock effect) and suppression of diastolic spontaneous, local Ca 2+ releases (LCRs) (Ca 2+ clock effect): as LCR size distributions shifted from larger to smaller values, the time of LCR occurrence during diastolic depolarization (LCR period) became prolonged, and the ensemble LCR Ca 2+ signal became reduced. The tight linear relationship of coupling between LCR period to the APCL in the presence of ado “drifted” upward and leftward, i.e. for a given LCR period, APCL was prolonged, becoming non-linear indicating clock uncoupling. An extreme case of uncoupling occurred at higher ado concentrations (>100 µM): small stochastic LCRs of the Ca 2+ clock failed to self-organize and synchronize to the membrane clock, thus creating a failed attempt to generate an AP resulting in arrhythmia and cessation of AP firing. Thus, the effects of ado to activate G βγ and I KACh, Ado and to activate G iα , suppressing adenylyl cyclase activity, both contribute to the ado-induced increase in the mean APCL and APCL variability by reducing the fidelity of clock coupling and AP firing rate.

The current functional paradigm of sinoatrial node (SAN), the hearts natural pacemaker, postulates the entrainment of full-scale action potentials (APs) at one common frequency and does not involve any subcellular events or subthreshold signals. SAN cells studied in isolation, however, generate subcellular, spontaneous, rhythmic, local Ca2+ releases (LCRs) and, while each LCR is a small, subthreshold signal, the emergent LCR ensemble signal critically contributes to generation of spontaneous APs and accounts for the heterogeneity of AP firing rates of these cells. We hypothesized that cells embedded in SAN tissue also generate heterogeneous subthreshold LCR signals of different rates and amplitudes and that self-organization of the LCRs within and among cells critically contributes to the ignition of APs that emerge from the SAN to excite the heart. To this end we combined immunolabeling with a novel technique to image microscopic Ca2+ dynamics, including both LCRs and AP-induced Ca2+ transients (APCTs) within and among individual pacemaker cells across the entire mouse SAN. Immunolabeling identified a meshwork of HCN4(+)/CX43(-) non-striated cells of different morphologies that extended along the crista terminalis from the superior vena cava to the inferior vena cava, becoming intertwined with a network of striated cells, rich in F-actin and CX43, but devoid of HCN4 immunolabeling. The earliest APCTs within a given pacemaker cycle occurred within a small area of HCN4 meshwork below the superior vena cava, just medial to the crista terminalis. Although subsequent APCT appearance throughout the SAN at low magnification resembled a continuous propagation pattern, higher magnification imaging revealed that APCT appearance at different sites within the SAN was patchy and discontinuous. Both LCR dynamics and APCTs were markedly heterogeneous in amplitudes and frequencies among SAN cells: in some cells, APCT occurrence was preceded by diastolic LCRs occurring in the same cell; other cells did not generate spontaneous APCTs, but had subthreshold LCRs only, which preceded APCT generation by adjacent cells; APCTs of various frequencies were generated steadily or in bursts. In summary, we discovered a novel, microscopic Ca2+ signalling paradigm of SAN operation that could not be detected with low-resolution, macroscopic tissue methods employed in prior studies: synchronized macroscopic signals within the SA node, including full-scale APs, emerge from heterogeneous microscopic subthreshold Ca2+ signals. This multiscale, complex process of impulse generation within the SAN resembles the emergence of organized signals from heterogeneous local signals generated within clusters of neurons within neuronal networks.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract The current theory of cardiac pacemaker rate modulation by the autonomic nervous system is based on the concept that a primary pacemaker cell or a group of cells in the center of the sinoatrial node (SAN) can change its AP firing rate within a broad range, driving respective myocardium contractions to commensurate body demands. Experimental data show, however, that pacemaker cells are extremely heterogeneous, with different areas of the SAN or cell clusters specializing to drive APs at specific rates. Thus, higher heart rates under stress are mainly driven by cell clusters in superior SAN, whereas low rates by cell clusters in inferior SAN, with basal state rates generated somewhere in the middle of the node. Cells within different clusters feature different intrinsic electrophysiological and Ca cycling properties, sympathetic and parasympathetic innervation, and vasculature, thereby supporting effective shift of the system to an optimal rate (under given conditions) accompanied by respective shifts in the leading pacemaker site. Thus, the popular single-cell-based pacemaker theory does not capture this complex emerging paradigm of pacemaker function of SAN tissue revealed by recent experimental studies. Here we propose a more realistic, conceptual model of heart rate autonomic modulation based on these studies. Our new model (the ‘gear model’) simulates the SAN as a brain-like structure featuring a small world of loosely connected clusters (functional modules) of tightly coupled cells, modeled as Maltsev-Lakatta coupled-clock system. One module (the higher chronotropic gear) generates higher AP rates in basal state and under β-adrenergic stimulation, but its activity is strongly suppressed by parasympathetic stimulation. The other module (the lower gear) generates lower rates and has low sensitivity to parasympathetic stimulation. Such modular, gear-like system reproduces the respective shifts of the leading pacemaker site observed experimentally and features a wide range of rate modulation and robust function whilst conserving energy. In perspective, future refinement and application of this new pacemaker tissue mechanism will provide better understanding of cardiac pacemaker function, its deterioration in aging and disease, and ultimately the creation of new therapies to treat sick sinus syndrome and other SAN function-related cardiac arrythmias.