Aquaporin-4 (AQP4) is the predominant water channel in the mammalian brain and an important drug target for treatment of cerebral edema, bipolar disorder and mesial temporal lobe epilepsy. We determined the AQP4 structure by electron crystallography of double-layered, two-dimensional (2D) crystals. The structure allows us to discuss how the expression ratio between the long and short AQP4 splicing variant can determine the size of in vivo orthogonal arrays. Furthermore, AQP4 contains a short 3(10) helix in an extracellular loop, which mediates weak but specific interactions between AQP4 molecules in adjoining membranes. This finding suggests a previously unexpected role for AQP4 in cell adhesion. This notion was corroborated by expression of AQP4 in L-cells, which resulted in clustering of the cells. Our AQP4 structure thus enables us to propose models for the size regulation of orthogonal arrays and channel-mediated cell adhesion.

Abstract Marseilleviridae is a family of the new order of giant viruses, which exhibit a characteristic inner membrane. Here, we investigated the entire structure of tokyovirus, a species of Marseillevirus at 7.7 Å resolution using 1 MV high-voltage cryo-EM and single particle analysis. The minor capsid lattice formed by five proteins, shows a novel structure compared to other icosahedral giant viruses. Under the minor capsid proteins, scaffold proteins connect two five-fold vertices and interact with the inner membrane. Previously reported giant viruses utilise “tape measure” proteins, proposed to control its capsid size, which could not be identified in tokyovirus, but scaffold proteins appear to perform a similar role. A density on top of the major capsid protein was identified, which suggested to be a 14kDa glycoprotein. Our observations suggest that the icosahedral particle of Marseilleviridae is constructed with a novel capsid protein network, which allows the characteristic inner membrane structure.

Abstract Microtubules are dynamic polymers consisting of αβ-tubulin heterodimers. The initial polymerization process, called microtubule nucleation, occurs spontaneously via αβ-tubulin. Since a large energy barrier prevents microtubule nucleation in cells, the γ-tubulin ring complex is recruited to the centrosome to overcome the nucleation barrier. However, detachment of a considerable number of microtubules from the centrosome is known to contribute to fundamental processes in cells. Here, we present evidence that minus-end-binding calmodulin-regulated spectrin-associated protein 2 (CAMSAP2) serves as a strong nucleator for microtubule formation from soluble αβ-tubulin independent of γ-tubulin. CAMSAP2 significantly reduces the nucleation barrier close to the critical concentration for microtubule polymerization by stabilizing the longitudinal contacts among αβ-tubulins. CAMSAP2 clusters together with αβ-tubulin to generate nucleation intermediates, from which numerous microtubules radiate, forming aster-like structures. Our findings suggest that CAMSAP2 supports microtubule growth by organizing a nucleation centre as well as by stabilizing microtubule nucleation intermediates.

Abstract F 1 domain of ATP synthase is a rotary ATPase complex in which rotation of central γ-subunit proceeds in 120° steps against a surrounding α 3 β 3 fueled by ATP hydrolysis. How the ATP hydrolysis reactions occurring in three catalytic αβ dimers are coupled to mechanical rotation is a key outstanding question. Here we describe catalytic intermediates of the F 1 domain during ATP mediated rotation captured using cryo-EM. The structures reveal that three catalytic events and the first 80° rotation occur simultaneously in F 1 domain when nucleotides are bound at all the three catalytic αβ dimers. The remaining 40° rotation of the complete 120° step is driven by completion of ATP hydrolysis at α D β D , and proceeds through three sub-steps ( 83° , 91° , 101° , and 120° ) with three associated conformational intermediates. All sub-steps except for one between 91° and 101° associated with phosphate release, occur independently of the chemical cycle, suggesting that the 40° rotation is largely driven by release of intramolecular strain accumulated by the 80° rotation. Together with our previous results, these findings provide the molecular basis of ATP driven rotation of ATP synthases.

Abstract V/A-ATPase is a motor protein that shares a common rotary catalytic mechanism with F o F 1 ATP synthase. When powered by ATP hydrolysis, the V 1 moiety rotates the central rotor against the A 3 B 3 hexamer, composed of three catalytic AB dimers adopting different conformations (AB open , AB semi , and AB closed ). Here we have determined the atomic models of 18 catalytic intermediates of the V 1 moiety of V/A-ATPase under different reaction conditions by single particle Cryo-EM, which revealed that the rotor does not rotate immediately after binding of ATP to the V 1 . Instead, three events proceed simultaneously with the 120° rotation of the shaft: hydrolysis of ATP in AB semi , zipper movement in AB open by the binding ATP, and unzipper movement in AB closed with release of both ADP and P i . This indicates the unidirectional rotation of V/A-ATPase by a ratchet-like mechanism owing to ATP hydrolysis in AB semi , rather than the power stroke model proposed previously for F 1 -ATPase.

Abstract Functional investigation of purified integral membrane proteins (IMPs) is hampered by the need to insert these hydrophobic proteins from the detergent-solubilized state into liposomal membranes. Here we report reintegration of IMPs into a lipid environment within minutes, an order of magnitude faster than currently used standard techniques. The new approach yielded optimal results for IMPs solubilized in the detergent lauryl-maltose neopentyl glycol (LMNG) and is therefore termed L MNG A uto- i nsertion R eintegration (LAiR). LAiR displays superior performance to standard methods in terms of protein activity, long-term stability and proton tightness of proteoliposomes. LAiR reconstituted vectorial control of membrane-bound activity by the transmembrane ion motive force, a property particularly important in mitochondrial function, which was undetectable by standard reintegration methods. LAiR also preserved fragile IMP properties that are prone to disruption upon reintegration, including long-term multi-subunit integrity, inhibitor susceptibility, and higher-order oligomeric states. LAiR proved suitable for reintegration into liposomes as well as into surface-tethered membrane bilayers, and was compatible with IMPs and lipids from prokaryotic and eukaryotic sources. We anticipate a broad scope for LAiR as a powerful tool in fundamental research, pharmaceutical applications, and biotechnology.

Protein translocation across the membrane is critical for microbial pathogenesis and various cellular functions. Bacterial binary toxins such as anthrax toxin are composed of enzyme components and a translocation channel, which catalyses substrate unfolding and translocation. Here we report the structures of the clostridial binary toxin (iota toxin) translocation channel Ib-pore and its complex with ADP-ribosyltransferase Ia. The Ib-pore structure at atomic resolution provides a similar structural framework as observed for the catalytic Φ-clamp of the anthrax protective antigen pore. However, the Ia-bound Ib-pore structure showed a unique binding mode of Ia: one Ia binds to the Ib-pore, and the Ia N-terminal domain interacts with Ib via two other Ib-pore bottlenecks with multiple weak interactions. Furthermore, Ib-binding induces Ia N-terminal α-helix tilting and partial unfolding, whereupon the unfolded N-terminus continues to the Φ-clamp gate. This study reveals the novel mechanism of N-terminal unfolding, which is crucial for protein translocation.

Abstract V-ATPase is an energy converting enzyme, coupling ATP hydrolysis/synthesis in the hydrophilic V 1 moiety, with proton flow through the V o membrane moiety, via rotation of the central rotor complex relative to the surrounding stator apparatus. Upon dissociation from the V 1 domain, the V o of eukaryotic V-ATPase can adopt a physiologically relevant auto-inhibited form in which proton conductance through the V o is prevented, however the molecular mechanism of this inhibition is not fully understood. Using cryo-electron microscopy, we determined the structure of both the holo V/A-ATPase and the isolated V o at near-atomic resolution, respectively. These structures clarify how the isolated V o adopts the auto-inhibited form and how the holo complex prevents the formation of this inhibited V o form. One Sentence Summary Cryo-EM structures of rotary V-ATPase reveal the ON-OFF switching mechanism of H + translocation in the V o membrane domain.