Flaviviruses , including Zika virus (ZIKV), are a significant global health concern, yet no licensed antivirals exist to treat disease. The small M (Membrane) protein plays well-defined roles during viral egress, yet remains within virion membranes following release and maturation. However, it is unclear whether M plays a functional role in this setting. Here, we show that M forms oligomeric membrane-permeabilising channels in vitro , with increased activity at acidic pH and sensitivity to the prototypic channel-blocker, rimantadine. In turn, rimantadine blocked an early stage of ZIKV cell culture infection. Molecular dynamics (MD) generated rationalised structure-based channel models, comprising hexameric arrangements of dual trans -membrane protomers. Interestingly, His28 protonation increased channel opening, consistent with activation within acidifying endosomes. Models contained a predicted lumenal binding site for rimantadine, as well as a second target region on the membrane-exposed periphery. In silico screening enriched for repurposed drugs/compounds predicted to bind to one or other site. Multiple hits displayed potency in vitro and in cell culture, supporting the relevance of channel models. Finally, rimantadine effectively blocked ZIKV viraemia in a preclinical model, supporting that M constitutes a physiologically relevant antiviral target, for either repurposing rimantadine, or the development of new ZIKV therapies.

We report the first cryoEM structure of the Hendra henipavirus nucleoprotein in complex with RNA, at 3.5 Angstrom resolution, derived from single particle analysis of homotetradecameric RNA-bound N protein rings exhibiting D14 symmetry. The structure of the HeV N protein adopts the common bi-lobed paramyxoviral N protein fold; the N-terminal and C-terminal globular domains are bisected by an RNA binding cleft containing six RNA nucleotides and are flanked by the N-terminal and C-terminal arms, respectively. In common with other paramyxoviral nucleocapsids, the lateral interface between adjacent N and N+1 protomers involves electrostatic and hydrophobic interactions mediated primarily through the N-terminal arm and globular domains with minor contribution from the C-terminal arm. However, the HeV N multimeric assembly uniquely identifies an additional interaction between N+1 and N-1 protomers. The model presented here broadens the understanding of RNA-bound paramyxoviral nucleocapsid architectures and provides a platform for further insight into the molecular biology of HeV, as well as the development of antiviral interventions.

Abstract We report the first cryoEM structure of the Hendra henipavirus nucleoprotein in complex with RNA, at 3.5 Å resolution, derived from single particle analysis of a double homotetradecameric RNA-bound N protein ring assembly exhibiting D14 symmetry. The structure of the HeV N protein adopts the common bi-lobed paramyxoviral N protein fold; the N-terminal and C-terminal globular domains are bisected by an RNA binding cleft containing six RNA nucleotides and are flanked by the N-terminal and C-terminal arms, respectively. In common with other paramyxoviral nucleocapsids, the lateral interface between adjacent N i and N i+1 protomers involves electrostatic and hydrophobic interactions mediated primarily through the N-terminal arm and globular domains with minor contribution from the C-terminal arm. However, the HeV N multimeric assembly uniquely identifies an additional protomer-protomer contact between the N i+1 N-terminus and N i−1 C-terminal arm linker. The model presented here broadens the understanding of RNA-bound paramyxoviral nucleocapsid architectures and provides a platform for further insight into the molecular biology of HeV, as well as the development of antiviral interventions.

Retroviral integrase can efficiently utilise nucleosomes for insertion of the reverse-transcribed viral DNA. In face of the structural constraints imposed by the nucleosomal structure, integrase gains access to the scissile phosphodiester bonds by lifting DNA off the histone octamer at the site of integration. To clarify the mechanism of DNA looping by IN, we determined a 3.9 Å resolution structure of the prototype foamy virus intasome engaged with a nucleosome core particle. The structural data along with complementary single-molecule Forster resonance energy transfer measurements reveal twisting and sliding of the nucleosomal DNA arm proximal to the integration site. Sliding the nucleosomal DNA by approximately two base pairs along the histone octamer accommodates the necessary DNA lifting from the histone H2A-H2B subunits to allow engagement with the intasome. Thus, retroviral integration into nucleosomes involves the looping-and-sliding mechanism for nucleosomal DNA repositioning, bearing unexpected similarities with chromatin remodelers.

Abstract The roles of RNA sequence/structure motifs, Packaging Signals (PSs), for regulating assembly of an HBV genome transcript have been investigated in an efficient in vitro assay containing only core protein (Cp) and RNA. Variants of three conserved PSs, within the genome of a strain not used previously, preventing correct presentation of a Cp-recognition loop motif are differentially deleterious for assembly of nucleocapsid-like particles (NCPs). Cryo-electron microscopy reconstruction of the T =4 NCPs formed with the wild-type gRNA transcript, reveal that the interior of the Cp shell is in contact with lower resolution density, potentially encompassing the arginine-rich protein domains and gRNA. Symmetry-relaxation of this reconstruction reveals that such contacts are made at every symmetry axis. We infer from their regulation of assembly that some of these contacts would involve gRNA PSs, and confirmed this by X-ray RNA footprinting. Mutation of the ε stem-loop in the gRNA, where polymerase binds in vivo , produces a poor RNA assembly substrate with Cp alone, largely due to alterations in its conformation. The results show that RNA PSs regulate assembly of HBV genomic transcripts in vitro , and therefore may play similar roles in vivo, in concert with other molecular factors.

Abstract Glycogen is the major glucose reserve in eukaryotes, and defects in glycogen metabolism and structure lead to disease. Glycogenesis involves interaction of glycogenin (GN) with glycogen synthase (GS), where GS is activated by glucose-6-phosphate (G6P) and inactivated by phosphorylation. We describe the 2.6 Å resolution cryo-EM structure of phosphorylated human GS revealing an autoinhibited GS tetramer flanked by two GN dimers. Phosphorylated N- and C-termini from two GS protomers converge near the G6P-binding pocket and buttress against GS regulatory helices. This keeps GS in an inactive conformation mediated by phospho-Ser641 interactions with a composite “arginine cradle”. Structure-guided mutagenesis perturbing interactions with phosphorylated tails led to increased basal/unstimulated GS activity. We propose that multivalent phosphorylation supports GS autoinhibition through interactions from a dynamic “spike” region, allowing a tuneable rheostat for regulating GS activity. This work therefore provides new insights into glycogen synthesis regulation and facilitates studies of glycogen-related diseases.