SUMMARY Small hairpin RNAs (shRNAs) allow highly efficient gene knockdown. Here we employed different shRNAs to knock down the reticulon RTN4A/NogoA in primary neurons. Depletion of NogoA correlates with altered synaptic protein composition and spontaneous neurotransmission. However, similar phenotypes are not observed upon genetic deletion of Nogo or its receptors. Step-wise introduction of mismatches in the seed region of shNogoA provides further evidence that synaptic phenotypes are NogoA-independent. RNA sequencing revealed global changes in the neuronal transcriptome of cultures transduced with the original shNogoA or closely related variants. Transcriptomic changes are shRNA seed sequence dependent, but not target-specific. Parallel sequencing of small non-coding RNAs revealed dysregulation of microRNAs. Computational analysis shows that the altered miRNA composition correlates with changes in mRNA expression and preferentially affects protein-protein networks that function at synapses. Thus, off-target effects associated with shRNAs are an inherent property, and in particular, altered miRNA composition needs careful consideration.

Abstract Long-lasting forms of synaptic plasticity such as synaptic scaling are critically dependent on transcription. Activity-dependent transcriptional dynamics in neurons, however, have not been fully characterized, because most previous efforts relied on measurement of steady-state mRNAs. Here, we profiled transcriptional dynamics of primary neuronal cultures undergoing network activity shifts using nascent RNA sequencing. We found pervasive transcriptional changes, in which ~45% of expressed genes respond to network activity shifts. Notably, the majority of these genes respond to increases or decreases of network activity uniquely, rather than reciprocally. We further linked the chromatin regulator Retinoic acid induced 1 (RAI1), the Smith-Magenis Syndrome gene, to the specific transcriptional program driven by reduced network activity. Finally, we show that RAI1 is essential for homeostatic synaptic upscaling but not downscaling. These results demonstrate the utility of bona fide transcription profiling to discover mechanisms of activity-dependent chromatin remodeling that underlie normal and pathological synaptic plasticity.

Transcriptional enhancers enable exquisite spatiotemporal control of gene expression in metazoans. Enrichment of mono-methylation of histone H3 lysine 4 (H3K4me1) is a major chromatin signature that distinguishes enhancers from gene promoters. Lysine Specific Demethylase 1 (LSD1), an enzyme specific for demethylating H3K4me2/me1, has been shown to decommission stem cell enhancers during the differentiation of mES cells (mESC). However, the roles of LSD1 in undifferentiated mESC remain obscure. Here, we show that LSD1 occupies a large fraction of enhancers (63%) that are primed with binding of transcription factors (TFs) and H3K4me1 in mESC. In contrast, LSD1 is largely absent at latent enhancers, which are not yet primed. Unexpectedly, LSD1 levels at enhancers exhibited a clear positive correlation with its substrate, H3K4me2 and enhancer activity. These enhancers gain additional H3K4 methylation upon the loss of LSD1 in mESC. The aberrant increase in H3K4me was accompanied with increases in enhancer H3K27 acetylation and expression of enhancer RNAs (eRNAs) and their target genes. In post-mitotic neurons, loss of LSD1 resulted in premature activation of enhancers and genes that are normally induced after neuronal activation. These results demonstrate that LSD1 is a versatile suppressor of primed enhancers, and is involved in homeostasis of enhancer activity.

XY male and XX female mammals equalize X-linked gene expression through the mitotically-stable transcriptional inactivation of an X-chromosome in females. Although most genes are silent on the inactive-X, some escape silencing and are expressed at higher levels in females vs. males. Here, we show that the escapee Smcx/Kdm5c, encoding a histone H3K4me2/3 demethylase, underlies the female-specific induction of X-inactivation. Mouse embryonic epiblast cells and differentiating embryonic stem cells (ESCs) lacking SMCX show reduced expression of Xist RNA, which is required for X-inactivation. Smcx-heterozygous epiblast cells do not silence X-linked genes efficiently, despite robust Xist expression. Overexpression of mouse or human SMCX, but not a catalytically-inactive SMCX or the Y-chromosome homolog SMCY, is sufficient to induce Xist and, separately, to silence X-linked genes in male ESCs. Finally, SMCX dose is inversely correlated with H3K4me2 at X-linked loci. Thus, X-inactivation initiates through the evolutionarily conserved, dose-dependent function of the histone demethylase SMCX.

Abstract Relapse, a critical issue in alcohol addiction, can be attenuated by disruption of alcohol-associated memories. Memories are thought to temporarily destabilize upon retrieval during the reconsolidation process. Here, we characterized the alcohol-specific transcriptional dynamics that regulate these memories. Using a mouse place-conditioning procedure, we found that alcohol memory retrieval increased the expression of Arc and Zif268 in the dorsal hippocampus (DH) and medial prefrontal cortex (mPFC). Alcohol seeking was abolished by post-retrieval non-specific inhibition of gene transcription in the DH, as well as by downregulating ARC expression in the DH using antisense-oligodeoxynucleotides. Since sucrose memory retrieval also increased Arc and Zif268 expression, we performed an RNA-sequencing assay, and revealed alterations in the expression of Adcy8, Neto1, Slc8a3 in the DH and Fkbp5 in the mPFC, caused by the retrieval of alcohol but not sucrose memories. This offers a first insight into the unique transcriptional dynamics underpinning alcohol memory reconsolidation.

Histone H3 lysine 4 methylation (H3K4me) is extensively regulated by seven writer and six eraser enzymes in mammals. Nine H3K4me enzymes are associated with neurodevelopmental disorders to date, indicating their important roles in the brain. Opposing activities of writer-eraser enzymes highlight activity modulation as a therapeutic strategy. However, interplay among H3K4me enzymes in the brain remains largely unknown. Here, we show functional interactions of a writer-eraser duo, KMT2A and KDM5C , which are responsible for Wiedemann-Steiner Syndrome (WDSTS), and mental retardation X-linked syndromic Claes-Jensen type (MRXSCJ), respectively. Despite opposite enzymatic activities, the WDSTS and MRXSCJ mouse models, deficient for either Kmt2a or Kdm5c , shared reduced dendritic spines and increased aggression. Double mutation of Kmt2a and Kdm5c clearly reversed dendritic morphology deficits and key behavioral traits including aggression, and partially corrected altered transcriptomes and H3K4me landscapes. Thus, our study uncovers common yet mutually suppressive aspects of the WDSTS and MRXSCJ models and provides a proof of principle for balancing a single writer-eraser pair to ameliorate their associated disorders.