ABSTRACT Three-dimensional chromatin organization varies across cell types and is essential for gene regulation. However, current technologies are unable to assess in vivo genome-wide chromatin organization non-invasively. Here we show that distant correlations in the fragment length of cell-free DNA (cfDNA) recapitulate three-dimensional chromatin organization. The inferred organization is highly concordant with that measured by Hi-C in white blood cells from healthy donors, and is not explained by technical bias or sequence composition. Furthermore, the inferred organization reflects different genomic organization in the various cell types contributing to cfDNA, allowing identification and quantification of tissues of origin. This approach is concordant with previous methods, but with more complete representations of cfDNA. Our results, demonstrated in cfDNA from healthy individuals and cancer patients, may enable noninvasive monitoring of in vivo genome organization and accurate quantification of cell death in different clinical conditions.

Abstract Deregulation of transcription factors (TFs) is an important driver of tumorigenesis. We developed and validated a minimally invasive method for assessing TF activity based on cell-free DNA sequencing and nucleosome footprint analysis. We analyzed whole genome sequencing data for >1,000 cell-free DNA samples from cancer patients and healthy controls using a newly developed bioinformatics pipeline that infers accessibility of TF binding sites from cell-free DNA fragmentation patterns. We observed patient-specific as well as tumor-specific patterns, including accurate prediction of tumor subtypes in prostate cancer, with important clinical implications for the management of patients. Furthermore, we show that cell-free DNA TF profiling is capable of early detection of colorectal carcinomas. Our approach for mapping tumor-specific transcription factor binding in vivo based on blood samples makes a key part of the noncoding genome amenable to clinical analysis.

Background: Blood-based methods using cell-free DNA (cfDNA) are under development as an alternative to existing screening tests. However, early-stage detection of cancer using tumor-derived cfDNA has proven challenging because of the small proportion of cfDNA derived from tumor tissue in early-stage disease. A machine learning approach to discover signatures in cfDNA, potentially reflective of both tumor and non-tumor contributions, may represent a promising direction for the early detection of cancer. Methods: Whole-genome sequencing was performed on cfDNA extracted from plasma samples (N=546 colorectal cancer and 271 non-cancer controls). Reads aligning to protein-coding gene bodies were extracted, and read counts were normalized. cfDNA tumor fraction was estimated using IchorCNA. Machine learning models were trained using k-fold cross-validation and confounder-based cross-validation to assess generalization performance. Results: In a colorectal cancer cohort heavily weighted towards early-stage cancer (80% stage I/II), we achieved a mean AUC of 0.92 (95% CI 0.91-0.93) with a mean sensitivity of 85% (95% CI 83-86%) at 85% specificity. Sensitivity generally increased with tumor stage and increasing tumor fraction. Stratification by age, sequencing batch, and institution demonstrated the impact of these confounders and provided a more accurate assessment of generalization performance. Conclusions: A machine learning approach using cfDNA achieved high sensitivity and specificity in a large, predominantly early-stage, colorectal cancer cohort. The possibility of systematic technical and institution-specific biases warrants similar confounder analyses in other studies. Prospective validation of this machine learning method and evaluation of a multi-analyte approach are underway.