Abstract Bacterial flagella self-assemble a strong, multi-component drive shaft that couples rotation in the inner membrane to the microns-long flagellar filament that powers bacterial swimming in viscous fluids. We here present structures of the intact Salmonella flagellar basal body, solved using cryo-electron microscopy to resolutions between 2.2 and 3.7 Å. The structures reveal molecular details of how 173 protein molecules of 13 different types assemble into a complex spanning two membranes and a cell wall. The helical drive shaft at one end is intricately interwoven with the inner membrane rotor component, and at the other end passes through a molecular bearing that is anchored in the outer membrane via interactions with the lipopolysaccharide. The in situ structure of a protein complex capping the drive shaft provides molecular insight into the assembly process of this molecular machine.

The bacterial flagellum is a complex, self-assembling, nanomachine that confers motility on the cell. Despite great variation across species, all flagella are ultimately constructed from a helical propellor attached to a motor embedded in the inner membrane. The motor consists of a series of stator units surrounding a central rotor made up of two ring complexes, the MS-ring and the C-ring. Despite many studies, high resolution structural information is still completely lacking for the MS-ring of the rotor, and proposed mismatches in stoichiometry between the two rings have long provided a source of confusion for the field. We here present structures of the Salmonella MS-ring, revealing an unprecedented level of inter- and intra-chain symmetry variation that provides a structural explanation for the ability of the MS-ring to function as a complex and elegant interface between the two main functions of the flagellum, protein secretion and rotation.

Suppressor of copper sensitivity protein C from Proteus mirabilis (PmScsC) is a homotrimeric disulfide isomerase that plays a role in copper tolerance - a key virulence trait of the uropathogen. Each protomer of the enzyme has an N-terminal trimerisation stem (59 residues) containing a flexible linker (11 residues) connected to a thioredoxin-fold-containing catalytic domain (163 residues). Here, we characterise two PmScsC variants, PmScsCΔN and PmScsCΔLinker. PmScsCΔN, is an N-terminally truncated form of the protomer with two helices of the trimerisation stem removed, generating a protein with dithiol oxidase rather than disulfide isomerase activity. The crystal structure of PmScsCΔN reported here reveals - as expected - a monomer that is structurally similar to the catalytic domain of native PmScsC. The second variant PmScsCΔLinker was designed to remove the 11 amino acid linker and we show that it generates a protein that has neither disulfide isomerase nor dithiol oxidase activity. The crystal structure of PmScsCΔLinker reveals a trimeric arrangement, with the catalytic domains packed together very closely. Small angle X-ray scattering analysis found that native PmScsC is predominantly trimeric in solution even at low concentration, whereas PmScsCΔLinker exists as an equilibrium between monomeric, dimeric and trimeric states, with the monomeric form dominating at low concentrations. These findings increase our understanding of disulfide isomerase activity, showing how (i) oligomerisation, (ii) spacing between, and (iii) dynamic motion of, catalytic domains in PmScsC all contribute to its native function.

F

Abstract Complement, contact activation, coagulation, and fibrinolysis are serum protein cascades that need strict regulation to maintain human health. Serum glycoprotein, C1-inhibitor (C1-INH) is a key regulator (inhibitor) of serine proteases of all the above-mentioned pathways. Recently, an autotransporter protein, Virulence Associated Gene 8 (Vag8) produced by the whopping cough causing pathogen, Bordetella pertussis has been shown to bind and interfere with C1-INH function. Here we present the structure of Vag8: C1-INH complex determined using cryo-electron microscopy at 3.6 Å resolution. The structure shows a unique mechanism of C1-INH inhibition not employed by other pathogens where Vag8 sequesters the Reactive Centre Loop of the C1-INH preventing its interaction with the target proteases. Importance The structure 105 kDa protein complex is one of the smallest to be determined using cryo-electron microscopy at high resolution. The mechanism of disrupting C1-INH revealed by the structure is crucial to understand how pathogens by producing a single virulence factor can disturb several homeostasis pathways. Virulence mechanisms such as the one described here assume more importance given the emerging evidence about dysregulation of contact activation, coagulation and fibrinolysis leading to COVID-19 pneumonia.