Abstract Tremendous genetic variation exists in nature, but our ability to create and characterize individual genetic variants remains far more limited in scale. Likewise, engineering proteins and phenotypes requires the introduction of synthetic variants, but design of variants outpaces experimental measurement of variant effect. Here, we optimize efficient and continuous generation of precise genomic edits in Escherichia coli , via in-vivo production of single-stranded DNA by the targeted reverse-transcription activity of retrons. Greater than 90% editing efficiency can be obtained using this method, enabling multiplexed applications. We introduce Retron Library Recombineering (RLR), a system for high-throughput screens of variants, wherein the association of introduced edits with their retron elements enables a targeted deep sequencing phenotypic output. We use RLR for pooled, quantitative phenotyping of synthesized variants, characterizing antibiotic resistance alleles. We also perform RLR using sheared genomic DNA of an evolved bacterium, experimentally querying millions of sequences for antibiotic resistance variants. In doing so, we demonstrate that RLR is uniquely suited to utilize non-designed sources of variation. Pooled experiments using ssDNA produced in vivo thus present new avenues for exploring variation, both designed and not, across the entire genome.

Abstract The emergence and spread of antibiotic resistance in bacterial pathogens is a global health threat. One important unanswered question is how antibiotic resistance influences the ability of a pathogen to invade the host-associated microbiome. Here we investigate how antibiotic resistance impacts the ability of the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa to invade the respiratory microbiome, by measuring the ability of P. aeruginosa spontaneous antibiotic resistant mutants to invade pre-established cultures of commensal respiratory microbes. We find that commensal respiratory microbes tend to inhibit the growth of P. aeruginosa , and antibiotic resistance is a double-edged sword that can either help or hinder the ability of P. aeruginosa to overcome this inhibition. The directionality of this help or hinderance depends on both P. aeruginosa genotype and respiratory microbe identity. Antibiotic resistance facilitates the invasion of P. aeruginosa into Staphylococcus lugdunensis, yet impairs invasion into Rothia mucilaginosa and Staphylococcus epidermidis . Streptococcus species provide the strongest inhibition to P. aeruginosa invasion, and this is maintained regardless of antibiotic resistance genotype. Our study demonstrates how antibiotic resistance can alter the ability of a bacterial pathogen to invade the respiratory microbiome and suggests that attempts to manipulate the microbiome should focus on promoting the growth of commensals that can provide robust inhibition of both wildtype and antibiotic resistant pathogen strains.

Isoprenoid quinones are bioactive molecules that include an isoprenoid chain and a quinone head. They are traditionally found to be involved in primary metabolism, where they act as electron transporters, but specialized isoprenoid quinones are also produced by all domains of life. Here, we report the engineering of a baker's yeast strain, Saccharomyces cerevisiae EPYFA3, for the production of isoprenoid quinones. Our yeast strain was developed through overexpression of the shikimate pathway in a well-established recipient strain ( S. cerevisiae EPY300) where the mevalonate pathway is overexpressed. As a proof of concept, our new host strain was used to overproduce the endogenous isoprenoid quinone coenzyme Q6, resulting in a final four-fold production increase. EPYFA3 represents a valuable platform for the heterologous production of high value isoprenoid quinones. EPYFA3 will also facilitate the elucidation of isoprenoid quinone biosynthetic pathways.

Abstract Antibiotic resistance tends to carry fitness costs, making it difficult to understand how resistance can be stably maintained in pathogen populations over the long-term. Here, we investigate this problem in the context of mcr-1 , a fitness-costly gene that confers resistance to the ‘last-resort’ antibiotic, colistin. Here we show that regulatory evolution has fine-tuned the expression of mcr-1 , allowing E. coli to reduce the cost of mcr-1 while simultaneously increasing colistin resistance. Conjugative plasmids have transferred low cost/high resistance mcr-1 alleles across an incredible diversity of E. coli strains, further stabilizing mcr-1 at the species level. Crucially, regulatory mutations were associated with increased mcr-1 stability in pig farms following a ban on the use of colistin as a growth promoter that decreased colistin consumption by 90%. Our study shows how the rapid evolution and horizontal transmission of resistance genes can combine to stabilize resistance and reduce the efficiency of interventions aimed at reducing AMR by limiting antibiotic consumption.