Green plants (Viridiplantae) include around 450,000-500,000 species1,2 of great diversity and have important roles in terrestrial and aquatic ecosystems. Here, as part of the One Thousand Plant Transcriptomes Initiative, we sequenced the vegetative transcriptomes of 1,124 species that span the diversity of plants in a broad sense (Archaeplastida), including green plants (Viridiplantae), glaucophytes (Glaucophyta) and red algae (Rhodophyta). Our analysis provides a robust phylogenomic framework for examining the evolution of green plants. Most inferred species relationships are well supported across multiple species tree and supermatrix analyses, but discordance among plastid and nuclear gene trees at a few important nodes highlights the complexity of plant genome evolution, including polyploidy, periods of rapid speciation, and extinction. Incomplete sorting of ancestral variation, polyploidization and massive expansions of gene families punctuate the evolutionary history of green plants. Notably, we find that large expansions of gene families preceded the origins of green plants, land plants and vascular plants, whereas whole-genome duplications are inferred to have occurred repeatedly throughout the evolution of flowering plants and ferns. The increasing availability of high-quality plant genome sequences and advances in functional genomics are enabling research on genome evolution across the green tree of life.

Abstract Convergent trait evolution is a recurrent phenomenon in all domains of the tree of life. While some convergent traits are caused by simple sequence changes, many are associated with extensive changes to the sequence and regulation of large cohorts of genes. It is unknown how organisms traverse this expansive genotype space to assemble such complex convergent phenotypes. C 4 photosynthesis is a paradigm of large-scale phenotypic convergence. Conceptual and mathematical models propose that C 4 photosynthesis evolved from ancestral C 3 photosynthesis through sequential adaptive changes. These adaptive changes could have been rapidly assembled if modifications to the activity and abundance of enzymes of the C 4 cycle was neutral in C 3 plants. This neutrality would enable populations of C 3 plants to maintain genotypes with expression levels of C 4 enzymes analogous to those in C 4 species and thus enable rapid assembly of a functional C 4 cycle from naturally occurring genotypes given shared environmental selection. Here we show that there is substantial natural variation in expression of genes encoding C 4 cycle enzymes between natural accessions of the C 3 plant Arabidopsis thaliana . We further show through targeted transgenic experiments in the C 3 crop Oryza sativa , that high expression of the majority of C 4 cycle enzymes in rice is neutral with respect to growth, development, biomass and photosynthesis. Thus, substantial variation in the abundance and activity of C 4 cycle enzymes is permissible within the limits of operation of C 3 photosynthesis and the emergence of component parts of this complex convergent trait can be facilitated by neutral variation.

Abstract We generated antisense constructs targeting two of the five Rubisco small subunit genes ( OsRBCS2 and 4 ) which account for between 30-40% of the RBCS transcript abundance in leaf blades. The constructs were driven by a maize phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) promoter known to have enriched expression in mesophyll cells (MCs). In the resulting lines leaf Rubisco protein content was reduced by between 30-50% and CO 2 assimilation rate was limited under photorespiratory and non-photorespiratory conditions. A relationship between Rubisco protein content and CO 2 assimilation rate was found. This was associated with a significant reduction in dry biomass accumulation and grain yield of between 37 to 70%. In addition to serving as a resource for reducing Rubisco accumulation in a cell-preferential manner, these lines allow us to characterize gene function and isoform specific suppression on photosynthesis and growth. Our results suggest that the knockdown of multiple genes is required to completely reduce Rubisco accumulation in MCs.

Background: C4 photosynthesis is a remarkable complex trait, elucidations of the evolutionary trajectory of C4 photosynthesis from its ancestral C3 pathway can help us to better understand the generic principles of complex trait evolution and guide engineering of C3 crops for higher yields. We used the genus Flaveria that contains C3, C3-C4, C4-like and C4 species as a system to study the evolution of C4 photosynthesis. Results: We mapped transcript abundance, protein sequence, and morphological features to the phylogenetic tree of the genus Flaveria, and calculated the evolutionary correlation of different features. Besides, we predicted the relative changes of ancestral nodes of those features to illustrate the key stages during the evolution of C4 photosynthesis. Gene expression and protein sequence showed consistent modification pattern along the phylogenetic tree. High correlation coefficients ranging from 0.46 to 0.9 among gene expression, protein sequence and morphology were observed, and the greatest modification of those different features consistently occurred at the transition between C3-C4 species and C4-like species. Conclusions: Our data shows highly coordinated changes in gene expression, protein sequence and morphological features. Besides, our results support an obviously evolutionary jump during the evolution of C4 metabolism.

Much of biology is associated with convergent traits, and it is challenging to determine the extent to which underlying molecular mechanisms are shared across phylogeny. By analyzing plants representing eighteen independent origins of C4 photosynthesis, we quantified the extent to which this convergent trait utilises identical molecular mechanisms. We demonstrate that biochemical changes that characterise C4 species are recovered by this process, and expand the paradigm by four metabolic pathways not previously associated with C4 photosynthesis. Furthermore, we show that expression of many genes that distinguish C3 and C4 species respond to low CO2, providing molecular evidence that reduction in atmospheric CO2 was a driver for C4 evolution. Thus the origin and architecture of complex traits can be derived from transcriptome comparisons across natural diversity.

Abstract Introduction of a C 4 photosynthetic pathway into C 3 rice ( Oryza sativa ) requires installation of a biochemical pump that concentrates CO 2 at the site of carboxylation in modified bundle sheath cells. To investigate the feasibility of this, we generated a quadruple line that simultaneously expresses four of the core C 4 photosynthetic enzymes from the NADP-malic enzyme subtype, phospho enol pyruvate carboxylase ( Zm PEPC), NADP-malate dehydrogenase ( Zm NADP-MDH), NADP-malic enzyme ( Zm NADP-ME) and pyruvate phosphate dikinase ( Zm PPDK), in a cell-specific manner. This led to enhanced enzyme activity but was largely neutral in its effects on photosynthetic rate and growth. Measurements of the flux of 13 CO 2 through photosynthetic metabolism revealed a significant increase in the incorporation of 13 C into malate, consistent with increased fixation of 13 CO 2 via PEP carboxylase in lines expressing the maize PEPC enzyme. We also showed 13 C labelling of aspartate indicating additional 13 CO 2 fixation into oxaloacetate by PEPC and conversion to aspartate by the endogenous aspartate aminotransferase activity. However, there were no significant differences in labelling of 3-phosphoglycerate (3PGA) or phospho enol pyruvate (PEP) indicating limited carbon flux through C 4 enzymes into the Calvin-Benson cycle. Crossing the quadruple line with a line with reduced glycine decarboxylase H-protein ( Os GDCH) abundance led to a photosynthetic phenotype characteristic of the reduced Os GDCH line and higher labelling of malate, aspartate and citrate. While Kranz anatomy or other anatomical modifications have not yet been installed in these plants to enable a fully functional C 4 cycle, these results demonstrate for the first-time flux through the carboxylation phase of C 4 metabolism in transgenic rice containing the key metabolic steps in the C 4 pathway.

In C4 plants the enzymatic machinery underpinning photosynthesis can vary, with for example, three distinct C4 acid decarboxylases being used to release CO2 in the vicinity of RuBisCO. For decades, these decarboxylases have been used to classify C4 species into three biochemical sub-types. However, more recently the notion that C4 species mix and match C4 acid decarboxylases has increased in popularity and, as a consequence, the validity of specific biochemical sub-types has been questioned. Using species from the grass tribe Paniceae we show that whilst transcripts encoding multiple C4 acid decarboxylases accumulate in bundle sheath cells in some species, in others, transcripts encoding only one enzyme are detected. In addition, a method that allows isolation of bundle sheath cells from a C3 species within the Paniceae, Sacciolepis indica, was developed. Deep sequencing of bundle sheath preparations from all four species combined with ancestral state reconstruction support the notion that the three biochemical C4 sub-types found in the Paniceae existed together in their most recent common ancestor. Thus, these species likely inherited the functional building blocks of all three C4 pathways. We conclude that classification of C4 plants into the classical biochemical sub-types is still appropriate for some species, and that evolution of this trait has been facilitated by characteristics of the ancestral C3 bundle sheath and made use of multiple convergent routes involving either one or multiple C4 acid decarboxylases.