Abstract The outcome of an encounter with Mycobacterium tuberculosis depends on the pathogen’s ability to adapt to the variable immune pressures exerted by the host. Understanding this interplay has proven difficult, largely because experimentally tractable animal models do not recapitulate the heterogeneity of tuberculosis disease. We leveraged the genetically diverse Collaborative Cross (CC) mouse panel in conjunction with a library of Mtb mutants to associate bacterial genetic requirements with host genetics and immunity. We report that CC strains vary dramatically in their susceptibility to infection and produce qualitatively distinct immune states. Global analysis of Mtb mutant fitness across the CC panel revealed that many virulence pathways are only in specific host microenvironments, identifying the large fraction of the pathogen’s genome that has been maintained to ensure fitness in a diverse population. Both immunological and bacterial traits were associated with genetic variants distributed across the mouse genome, identifying the specific host-pathogen genetic interactions that influence pathogenesis.

Abstract The immunological synapse allows antigen presenting cells (APC) to convey a wide array of functionally distinct signals to T cells, which ultimately shape the immune response. The relative effect of stimulatory and inhibitory signals is influenced by the activation state of the APC, which is determined by an interplay between signal transduction and metabolic pathways. While toll-like receptor ligation relies on glycolytic metabolism for the proper expression of inflammatory mediators, little is known about the metabolic dependencies of other critical signals such as interferon gamma (IFNγ). Using CRISPR-Cas9, we performed a series of genome-wide knockout screens in macrophages to identify the regulators of IFNγ-inducible T cell stimulatory or inhibitory proteins MHCII, CD40, and PD-L1. Our multi-screen approach enabled us to identify novel pathways that control these functionally distinct markers. Further integration of these screening data implicated complex I of the mitochondrial respiratory chain in the expression of all three markers, and by extension the IFNγ signaling pathway. We report that the IFNγ response requires mitochondrial respiration, and APCs are unable to activate T cells upon genetic or chemical inhibition of complex I. These findings suggest a dichotomous metabolic dependency between IFNγ and toll-like receptor signaling, implicating mitochondrial function as a fulcrum of innate immunity.

Abstract Cytokine-mediated activation of host immunity is central to the control of pathogens. A key cytokine in protective immunity is interferon-gamma (IFNγ), which is a potent activator of antimicrobial and immunomodulatory effectors within the host. A major role of IFNγ is to induce major histocompatibility complex class II molecules (MHCII) on the surface of cells, which is required for CD4 + T cell activation. Despite its central role in host immunity, the complex and dynamic regulation of IFNγ-induced MHCII is not well understood. Here, we integrated functional genomics and transcriptomics to comprehensively define the genetic control of IFNγ-mediated MHCII surface expression in macrophages. Using a genome-wide CRISPR-Cas9 library we identified genes that control MHCII surface expression, many of which have yet to be associated with MHCII. Mechanistic studies uncovered two parallel pathways of IFNγ-mediated MHCII control that require the multifunctional glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β) or the mediator complex subunit MED16. Both pathways are necessary for IFNγ-mediated induction of the MHCII transactivator CIITA, MHCII expression, and CD4 + T cell activation. Using transcriptomic analysis, we defined the regulons controlled by GSK3β and MED16 in the presence and absence of IFNγ and identified unique networks of the IFNγ-mediated transcriptional landscape that are controlled by each gene. Our analysis suggests GSK3β and MED16 control distinct aspects of the IFNγ-response and are critical for macrophages to respond appropriately to IFNγ. Our results define previously unappreciated regulation of MHCII expression that is required to control CD4 + T cell responses by macrophages. These discoveries will aid in our basic understanding of macrophage-mediated immunity and will shed light on mechanisms of failed adaptive responses pervasive in infectious disease, autoimmunity, and cancer.

Host genetics plays an important role in determining the outcome of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. We previously found that Collaborative Cross mouse strains differ in their susceptibility to Mtb, and that the CC042/GeniUnc (CC042) strain suffered from a rapidly progressive disease and failed to produce the protective cytokine, IFNγ, in the lung. Here, we used parallel genetic and immunological approaches to investigate the basis of CC042 susceptibility. Using a population derived from a CC001/Unc (CC001) x CC042 intercross, we mapped four QTL underlying Tuberculosis ImmunoPhenotypes (Tip1-4). These included 2 major effect QTL on Chromosome 7 (Tip1 and Tip2) that were associated with bacterial burden. Tip2, along with Tip3 (Chromosome 15) and Tip4 (Chromosome 16) also correlated with IFNγ production following infection, whereas Tip1 appeared to control an IFNγ-independent mechanism of bacterial control. Further immunological characterization revealed that CC042 animals recruited relatively few antigen-specific T cells to the lung and these T cells failed to express the Integrin alpha L (αL; i.e., CD11a), which contributes to T cell activation and migration. These defects could be explained by a CC042 private variant in the Itgal gene, which encodes CD11a, and is found within the Tip2 interval. This 15bp deletion leads to aberrant mRNA splicing and is predicted to result in a truncated protein product. The ItgalCC042 genotype was associated with all measured disease traits, indicating that this variant is a major determinant of susceptibility in CC042. The combined effect of functionally distinct Tip variants likely explains the profound susceptibility of CC042 and highlights the multigenic nature of TB control in the Collaborative Cross.

Protection from infectious disease relies on two distinct mechanisms. 'Antimicrobial resistance' directly inhibits pathogen growth, whereas 'infection tolerance' controls tissue damage. A single immune-mediator can differentially contribute to these mechanisms in distinct contexts, confounding our understanding of protection to different pathogens. For example, the NADPH-dependent phagocyte oxidase complex (Phox) produces anti-microbial superoxides and protects from tuberculosis in humans. However, Phox-deficient mice do not display the expected defect in resistance to M. tuberculosis leaving the role of this complex unclear. We re-examined the mechanisms by which Phox contributes to protection from TB and found that mice lacking the Cybb subunit of Phox suffered from a specific defect in tolerance, which was due to unregulated Caspase1 activation, IL-1β production, and neutrophil influx into the lung. These studies demonstrate that Phox-derived superoxide protect against TB by promoting tolerance to persistent infection, and highlight a central role for Caspase1 in regulating TB disease progression.