In chronic lymphocytic leukemia (CLL) the level of minimal residual disease (MRD) after therapy is an independent predictor of outcome. Given the increasing number of new agents being explored for CLL therapy, using MRD as a surrogate could greatly reduce the time necessary to assess their efficacy. In this European Research Initiative on CLL (ERIC) project we have identified and validated a flow-cytometric approach to reliably quantitate CLL cells to the level of 0.0010% (10−5). The assay comprises a core panel of six markers (i.e. CD19, CD20, CD5, CD43, CD79b and CD81) with a component specification independent of instrument and reagents, which can be locally re-validated using normal peripheral blood. This method is directly comparable to previous ERIC-designed assays and also provides a backbone for investigation of new markers. A parallel analysis of high-throughput sequencing using the ClonoSEQ assay showed good concordance with flow cytometry results at the 0.010% (10−4) level, the MRD threshold defined in the 2008 International Workshop on CLL guidelines, but it also provides good linearity to a detection limit of 1 in a million (10−6). The combination of both technologies would permit a highly sensitive approach to MRD detection while providing a reproducible and broadly accessible method to quantify residual disease and optimize treatment in CLL.

Human blood and lymph contain circulating CD4 + CD103 + cutaneous resident memory T cells that can seed distant skin sites. See the related Focus by Carbone and Gebhardt .

ABSTRACT Stromal cells contribute to organ integrity as fibroblasts and to vascular stability as pericytes, in addition to their enigmatic niche function in many tissues. Their inherent immunomodulatory capacity attracted particular attention, initiating numerous clinical trials, particularly testing trophic regeneration and immunomodulation. Key stromal immune functions are still enigmatic. Here we show that dedicator of cytokinesis (DOCK-2) previously described for causing immune cell dysfunction plays a role in extra-hematopoietic immunity by regulating stromal/fibroblast immunomodulatory function. We used three independent strategies including iPSC-derived mesodermal stromal cell (MSC) lineage maturation, severe combined immunodeficiency (SCID) patient-derived cells and CRISPR/Cas9 knockout to support our findings. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) were generated from healthy bone marrow and umbilical cord blood-derived fibroblasts by Sendai virus-mediated transient expression of Yamanaka factors. After mesoderm induction, stromal differentiation was induced by platelet-derived growth factors under animal serum-free conditions. Under feeder-free defined conditions, iPSCs differentiated into expandable and cryo-preservable CD73 + /CD105 + /Tra-1-81 − early iPS-MSCs lacking immunosuppressive potential. Successive maturation was required for reaching the canonical MSC phenotype and immunomodulatory competence over time, while maintaining clonogenicity, comparable to parental MSCs. Sequential RNAseq revealed acquisition of a spectrum of immune-related genes significantly expressed in mature iPS-MSCs and resembling parental MSC’s immune gene expression. The DOCK-2 gene attracted our attention because mutations can cause SCID. Interestingly, SCID patient-derived fibroblast lines harboring bi-allelic DOCK-2 mutations showed significantly reduced immunomodulatory capacity compared to non-mutated control fibroblasts. CRISPR/Cas9-mediated DOCK-2 knockout in healthy iPSCs resulted in iPS-MSCs that also displayed reduced immunomodulatory capacity, thus confirming a role of DOCK-2 in stromal immune function. At a mechanistic level, DOCK-2 deficiency resulted in disturbed subcellular localization of CDC42. This provides first evidence for an extra-hematopoietic immunomodulatory role of DOCK-2 in stromal cells, previously considered restricted to hampering immune cell migration/function resulting in SCID. We may speculate that some of the signs and symptoms of persisting immune disease after successful hematopoietic stem cell transplantation in SCID patients could at least in part be due to mutations, like DOCK-2 −/− , permissive outside the hematopoietic immune system, as evidenced also by the increased virus infection susceptibility of DOCK-2 deficient fibroblasts.

Tissue-resident memory T cells (TRM) persist locally in non-lymphoid tissues where they provide front-line defense against recurring insults. TRM at barrier surfaces express the markers CD103 and/or CD69 which function to retain them in epithelial tissues. In humans, neither the long-term migratory behavior of TRM nor their ability to re-enter the circulation and potentially migrate to distant tissue sites have been investigated. Using tissue explant cultures, we found that CD4+CD69+CD103+ TRM in human skin can downregulate CD69 and exit the tissue. Additionally, we identified a skin-tropic CD4+CD69-CD103+ population in human lymph and blood that is transcriptionally, functionally and clonally related to the CD4+CD69+CD103+ TRM population in the skin. Using a skin xenograft model, we confirmed that a fraction of the human cutaneous CD4+CD103+ TRM population can re-enter circulation, and migrate to secondary human skin sites where they re-assume a TRM phenotype. Thus, our data challenge current concepts regarding the strict tissue compartmentalization of CD4+ T cell memory in humans.

Allogeneic regenerative cell therapy has shown surprising results despite lack of engraftment of the transplanted cells. Their efficacy was so far considered to be mostly due to secreted trophic factors. We hypothesized that extracellular vesicles (EVs) can also contribute to their mode of action. Here we provide evidence that EVs derived from therapeutic placental-expanded (PLX) stromal cells are potent inducers of angiogenesis and modulate immune cell proliferation in a dose-dependent manner. Crude EVs were enriched >100-fold from large volume PLX conditioned media via tangential flow filtration (TFF) as determined by tunable resistive pulse sensing (TRPS). Additional TFF purification was devised to separate EVs from cell-secreted soluble factors. EV identity was confirmed by western blot, calcein-based flow cytometry and electron microscopy. Surface marker profiling of tetraspanin-positive EVs identified expression of cell- and matrix-interacting adhesion molecules. Differential tandem mass tag proteomics comparing PLX-EVs to PLX-derived soluble factors revealed significant differential enrichment of 258 proteins in purified PLX-EVs involved in angiogenesis, cell movement and immune system signaling. At the functional level, PLX-EVs and cells inhibited T cell mitogenesis. PLX-EVs and soluble factors displayed dose-dependent proangiogenic potential by enhancing tube-like structure formation in vitro. Our findings indicate that the mode of PLX action involves an EV-mediated proangiogenic function and immune response modulation that may help explaining clinical efficacy beyond presence of the transplanted allogeneic cells.